改良的两步复合酶消化法制备大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞

周玥华，刘 星，张艳军，汪 辛，陈渝萍*

(1.西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室，成都 610031； 2.西南交通大学材料科学与工程学院，成都 610031)

改良的两步复合酶消化法制备大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞

周玥华1,2，刘 星1,2，张艳军1,2，汪 辛1,2，陈渝萍1,2*

(1.西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室，成都 610031； 2.西南交通大学材料科学与工程学院，成都 610031)

目的 本文报道一种基于复合酶消化法进行改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的分离方法。方法 采用胶原酶、胰肽酶复合酶对胸主动脉进行初步消化去除内外膜、再对中膜进行二次消化释放血管平滑肌细胞。结果 细胞分离后贴壁生长，多具梭形形态，呈现典型的“峰-谷”生长状态，1周可进行传代；多种收缩型血管平滑肌细胞的分子标记基因均在所分离培养的细胞中高表达；超过95%的细胞为alpha smooth muscle actin(α-SMA)和myosin-II显著阳性。结论 本分离方法简捷易行、重复性好，所得细胞活性佳、纯度高，可确保短时间内获得大量收缩型血管平滑肌细胞。

血管平滑肌细胞；复合酶；两步消化法

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)参与了高血压、动脉粥样硬化和血管再狭窄等疾病的发生发展[1-4]，关于VSMC的研究是心血管疾病细胞分子病理学的重要内容，而其开展的前提是获得结构功能良好的VSMC。

目前VSMC 体外分离培养方法大致分为组织块贴壁法、酶消化法两大类。前者使用器械剥离内外膜、并将血管剪成小块进行贴壁培养，最后VSMC从组织块爬出[5-9]。该方法费用低廉，是目前国内较为通用的VSMC分离方法。但是其缺点显而易见：1)组织块极易漂浮而造成分离失败[2,10]。2)内外膜容易有残留、中膜层容易被易刮伤。因此，使用该方法分离出的VSMC活力欠佳，需要2 ～ 4周(甚至7周)才可传代；且细胞纯度低，传代培养5代左右才能达到98%纯度[2,11,12]。更有研究显示，使用该方法所分离的VSMC的收缩表型特征明显减弱[13]，不能满足多种收缩型VSMC的研究工作[3,14]。

自1978年Ives等[15]人采用蛋白酶直接消化血管组织来制备VSMC以来，先后有人尝试了胶原酶、胰酶和胰肽酶等蛋白酶[16-21]。传统的酶消化法用酶单一，消化时间可从几个小时长至几天。组织的消化不均匀，细胞产量少。除此之外，胰酶对VSMC有损伤。后期进一步发展出多种蛋白酶联合消化的方法来改善细胞产量和活性以提高分离的成功率和稳定性[22-24]。但是，迄今报道的各种复合酶消化方法中，所使用的酶的种类及数量较多，操作步骤繁琐冗长，污染率较高。而且，因酶制品的差异，消化时间不能得到统一。这些问题的存在使得该方法难以为初学者掌握、分离效果不一，尚未为国内研究者大量采用[16]。因此，尚待建立一种成功率高、且更简便易行的VSMC分离制备方法，以满足现今VSMC研究工作进行的需要。

为此，我们考察了国内外各种VSMC分离方法[16,17,25,26]，对实验细节反复摸索和优化，建立了一种改良的复合酶消化法，并成功地应用该方法进行了大鼠VSMC的分离制备。和报道的其它VSMC分离制备方法相比，该方法操作简捷易行，操作时间短。分离的重复性极好、成功率很高，可确保所获得的VSMC的数量、活性、纯度及其收缩型表型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂

含钙镁HBSS、不含钙镁的PBS、DMEM-F12高糖培养基均来自Hyclone；0.25%的胰酶细胞消化液、双抗和胎牛血清来自Gibco；二型胶原酶(collagenaseⅡ)、胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)和胰肽酶E(elastase)来自Worthington Biochem；DMSO和细胞计数试剂盒CCK8分别购自Sigma和北京庄盟；RNA分析试剂包括Trizol试剂、逆转录试剂盒和DNase I(Thermofisher，美国)和定量PCR试剂(Bio-Rad，美国)；基因引物于上海生工合成，各基因的特异序列见表1；免疫分析试剂包括DAPI和RIPA(Sigma，美国)、正常兔IgG(Santa Cruz，美国)、α-SMA、myosin-II和β-tubulin的兔抗(Abcam，美国)及Alexa Fluor 594羊抗兔二抗购自(Invitrogen，美国)。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

1.1.2 实验仪器

超净工作台(苏州净化设备集团)；气浴恒温振荡器(金坛市鸿科仪器厂)；细胞培养箱(Thermo Forma，美国)；倒置显微镜(Leica DMIL，美国)；荧光显微照相设备(Leica，美国)；Image Lab(Bio-Rad，美国)；Real-time quantitative PCR detecting system(CFX96，Bio-Rad，美国)；Power Pac Universal(Bio-Rad，新加坡)。

1.1.3 实验动物

健康的SPF级别SD雄性大鼠，体重90～100 g，购自四川省人民医院实验动物研究所【SCXK(川)2013-15】。

1.2 方法

1.2.1 复合酶液的配制

实验开始前以HBSS新鲜配制复合酶消化液(二型胶原酶，1 mg/mL；胰蛋白酶抑制剂，1 mg/mL；胰肽酶，7.08 μL/mL)。配制好的酶液置于37℃、摇速60 r/min的气浴恒温振荡器里预热(备注：一条大鼠的胸主动脉约用2 mL的复合酶液)。

1.2.2 原代VSMC的分离

取乙醚麻醉大鼠，转至无菌动物手术台，用75%的酒精喷湿大鼠的胸腹部，剖开胸腹腔充分暴露胸主动脉血管。小心剔除粘附在血管上的组织和粘膜，迅速剪取胸主动脉置于高压灭菌、预冷的生理盐水中并转移到细胞培养室的超净工作台；反复冲洗血管表面的血污，用2 mL的注射器吸取生理盐水进一步冲洗管腔内的凝血块等(3次左右)。在保证不伤害血管的前提下，小心剔净其表面黏附的纤维组织，立即放入含1 mL复合酶液的4 mL离心管中，在37℃的气浴恒温振荡器里消化45 min，摇速60 r/min。随后将血管置于预冷的、带双抗的DMEM中，用弯头和直头眼科小镊子轻柔剥离血管外膜；漂洗后再用弯头的小剪刀纵向剪开血管，以弯头小镊轻轻刮除内膜，最后以HBSS漂洗剥离的中膜层。

将中膜层置于干净的培养皿，以弯头眼科剪快速剪成1 ～ 2 mm3小块，转入放有1 mL复合酶液的6孔板，转移到孵箱中，37℃，5% CO2，消化1 h；每消化20 min后取出孔板轻轻晃动；消化50 min后开始观察细胞从组织碎块游离的情形。待多数组织块中的细胞开始脱落时加入预热过的含20% FBS的DMEM-F12培养基终止消化。随后用10 mL注射器抽打组织消化液以帮助细胞进一步从组织残片中脱离(大致10 ～ 20次)，再用40 μm的细胞筛过滤悬液到6孔板的另一个孔内，获得VSMC细胞悬液。取滤网上的组织、重复抽打和过滤1次，将2次过滤后的细胞悬液一起转移到15 mL的离心管里，1 000 r/min离心5 min收集细胞。最后取含20%FBS和抗生素的DMEM-F12重新悬浮细胞，种入6孔板进行培养(P0代)，静置48 h后开始观察。

1.2.3 原代VSMC的传代培养和冻存

一周后P0代细胞基本长满孔板(90%)，以0.25%胰蛋白酶液消化VSMC，重悬于含20%FBS 的DMEM，并于直径10 cm培养皿中进行传代培养(P1代)。细胞再次长满后进行同样的消化传代(P2代)，从P2代开始进行VSMC冻存。P5代以后的VSMC以含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)进行培养。

1.2.4 VSMC的细胞形态学观察

VSMC分离培养2 d后开始以倒置相差显微镜观察培养状态下细胞的形态和生长情形。

1.2.5 VSMC的生长活力测定

将P2代细胞以每孔约1000个细胞/100 μL培养基接种于96孔板，置细胞培养箱内培养。以CCK-8试剂盒定期分析孔内细胞数量，检测细胞生长情形。每次测定6孔，连续测3 d。

1.2.6 VSMC的ICC(细胞免疫荧光)

分析将P2代细胞接种于内置细胞爬片的24孔板中培养1 d。取出爬片，以4% PFA于室温固定20 min，后以甲醇于-20℃透膜10 min，然后用封闭液(1%BSA，4%羊血清，0.1% Tween20，0.1 mol/L甘氨酸)在室温下封闭45 min。分别与α-SMA一抗 (1∶500)、Myosin-II一抗(1∶100)和相应等量的正常兔IgG在4℃孵育过夜，然后再和Alexa Fluor 594偶联的羊抗兔二抗(1∶1000)于室温避光孵育1 h。每一步孵育前样品均以PBS 漂洗三遍。最后以DAPI染核，并于荧光显微镜下进行观察。

1.2.7 VSMC的收缩型表型基因的表达分析

取Trizol试剂分别裂解P2代VSMC和大鼠肝星状细胞株T6细胞，提取总RNA；RNA定量后以逆转录试剂盒制备cDNA、随后进行定量PCR反应以分析细胞中各表型基因的RNA表达水平；并以2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段。以RIPA液裂解P2、P3、P4代细胞、T6细胞和Hela细胞，分别制备细胞总蛋白；定量蛋白浓度后进行Western Blot分析，定量检测α-SMA、myosin-II和β-tubulin蛋白在细胞中的表达水平。

2 结果

2.1 VSMC的分离制备

为获得高产量、高活性的VSMC，我们采用复合酶二步消化的方法进行VSMC的分离制备。胸主动脉在以复合酶液初步消化45 min后，外、内膜可被轻松剥离和刮除，顺利获得完整的中膜。对剪碎的中膜组织块进一步进行二次消化，可解除内外弹性膜对VSMC的束缚。图1A了显示中膜组织碎块在两步酶消化结束时在显微镜下观察的情形。可见组织碎块中多个细胞正在逃逸胶原等蛋白纤维的束缚，呈葡萄串状贴附于组织块。将分离后的P0代细胞接种于6孔板，起初细胞呈球状(图1B)；12 h后贴壁的细胞开始拉长，并呈明暗交替分布；培养2 d后细胞逐渐铺展开，初显VSMC形态，呈梭形、长条形和三角形生长(图1C)。接种7 ～ 8 d后P0代细胞接近长满，密集生长处细胞重叠生长，可观察到明显的峰-谷生长态势(图1D)。随后以胰酶消化细胞、传代于10 cm培养皿中，约1周后P1代细胞再次长满，数量可达约100万。

注：(A)酶消化结束时被蛋白纤维缠绕的VSMCs；(B)分离接种于6孔板的P0代VSMCs； (C)培养两天的VSMCs；(D)体外培养1周后的VSMCs。图1 VSMC的分离和培养Note.(A) VSMCs tangled with protein fibers at the end of digestion; (B) Isolated P0 VSMCs in 6-well plate; (C) VSMCs after cultured for two days; (D) VSMCs were cultured for a week in vitro.Fig.1 Isolation and culture of VSMCs

2.2 VSMC的生长活力

为了检测所分离的VSMC的生长能力，我们取P2代VSMC接种于96孔板，持续培养4 d。培养期间定时取细胞以CCK8试剂盒处理、检测孔内生长的活细胞数。如图2所示，在培养的96 h内，细胞数量逐渐增多。细胞在经过接种初期的适应后，其增长开始显著加快，生长旺盛，显示出极佳的增殖活力。表明我们所分离的细胞具有良好的活力。

图2 第二代VSMCs的增殖分析Fig.2 Proliferation analysis of the P2VSMCs

2.3 VSMC的ICC分析(细胞免疫荧光)

取培养的P2代VSMC细胞作免疫荧光分析，进一步对所分离的VSMC细胞进行鉴定。我们首先检测了α-SMA这一最常用的SMC分子标记蛋白。其次，考虑到近期研究发现一系列传统的SMC分子标记(包括α-SMA，SM22，h1-calponin和smoothelin等)在其它类型细胞中也有较高表达，我们还选择了检测myosin-II这一目前公认的更特异的SMC分子标记[3]。如图3显示，α-SMA和myosin-II蛋白抗体均在所分离的P2代VSMC细胞中产生了清晰的红色荧光信号，表明细胞表达收缩型VSMC的特征性蛋白。荧光显微镜下可见α-SMA肌动蛋白丝状纤维与细胞长轴平行、向两头成放射分散，胞质均匀、细胞核轮廓清晰可见；尤其是myosin-II 免疫荧光信号在细胞中也非常显著，意味着该蛋白在细胞内水平很高(图3)。对两个平行培养孔内各4处视野里的细胞进行计数和统计，发现ICC检测α-SMA和myosin-II蛋白阳性细胞的比率可达95%，表明在传至P2代时所分离的细胞中收缩型VSMC的纯度已经达到95%。这些结果说明使用本方法主要获得的是高纯度的收缩型VSMC。

注：(A)蛋白α-SMA；(B)对应(A)的细胞核DAPI染色；(C)合并A & B；(D)蛋白myosin-II； (E)对应(D)的细胞核DAPI染色；(F)合并D & E。图3 细胞免疫荧光Note. (A) α-SMA; (B) DAPI-stained cell nucli of (A); (C) Merge of A & B; (D) Myosin-II; (E) DAPI-stained cell nuclei of (D); (F) Merge of D & E.Fig.3 Immunofluorescence assay of the P2 VSMCs

2.4 VSMC的mRNA和蛋白的表达分析

我们对分离培养的VSMC表型基因的表达情形还进行了RNA和蛋白的定量分析。首先以实时定量PCR分析了所分离的细胞中各类收缩型VSMC典型性状基因的表达情形。如图4A所示，两次单独分离的P2代VSMC细胞均高水平表达一系列VSMC收缩型表型标记物基因，如Acta2、Myh11、Tagln等；且控制这些表型基因表达的主要转录调控因子Myocardin的基因也在细胞中表达[27]。较T6这种肌纤维化样的肝星状细胞，分离的VSMC中Acta2和Tagln的表达水平明显增高，表明这些细胞维持更强的收缩型VSMC基因表达。以2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，发现它们均为单一条带(图4B)，说明基因扩增的特异性。

注：(A)P2代VSMCs各基因RNA水平的定量PCR分析；(B)PCR产物的2%琼脂糖凝胶电泳结果。图4 VSMCs的mRNA表达分析Note. (A)Quantitative PCR analysis of RNA levels of genes in the P2 VSMCs; (B) Results of 2% agarose gel electrophoresis of the PCR products.Fig.4 mRNA expression analysis of the VSMCs

随后取P2 ～ P4代VSMC、T6和HeLa细胞总蛋白进行Western blot，定量分析细胞中α-SMA和myosin-II的蛋白表达情形。如图5所示，两种蛋白在所有被检细胞中都有一定表达，但在分离的VSMC中的表达水平显著高于T6和HeLa细胞，说明所分离的VSMC在传至P4代时仍然维持极好的收缩型VSMC表型性状。

图5 VSMCs的蛋白表达分析Fig.5 Protein expression analysis of the VSMCs

最后，鉴于分离的原代VSMC在培养过程中逐渐从收缩型表型向合成型表型转变，我们比较了培养至P4代和P8代时，所分离的VSMC中表型基因表达情形的差异。从图6可以清楚地看见，较P4代VSMC， P8代细胞中Myh11的RNA水平急剧下降，α-SMA的RNA表达也下调但幅度小。图6还显示了myocardin和Kruppel-like factor 4这对调控SMC收缩表型基因表达的正负转录调控因子的表达情形。它们的RNA表达水平在P4代和P8代分别逆转，前者水平由高变低，后者水平从低到高，共同调控着细胞从收缩型表型向合成型表型的转变。

注：(A)收缩表型基因；(B)转录调控因子基因。图6 P4和P8代VSMC的RNA表达水平比较Note. (A) contractile gene; (B) the gene of transcription regulatory factors.Fig.6 Comparison of RNAs expression levels between the P4 and P8 VSMCs

3 讨论

在实验中我们对传统的复合酶消化方法进行了反复摸索改良，精确调制了复合酶的配制和消化时间以提高消化效果，获得了很好的分离效果；同时还对每一步操作细节加以细化，使其可为初学者轻松掌握。主要的改进点为：(1)选择90 ～ 100 g的大鼠作为胸主动脉取材对象，既保证了VSMC的增殖分化潜能，又满足了操作要求；(2)选取胶原蛋白酶和胰肽酶配制复合酶，保证中膜层中VSMC的释放；(3)在酶消化液中添加了胰酶抑制剂，改善所分离细胞的活力；(4)利用空气摇床震荡进行初步消化，促使血管内外膜充分接触混合酶液、消化时间减少为45 min，利于内外膜的剥离，减少内外膜与中膜层的牵拉，提高了细胞活性和细胞纯度；(5)将剥离的中膜层剪成组织碎块，转入6孔板在细胞培养箱内进行再消化，每间隔20 min略加晃动，充分保证酶的消化效果，消化时间也被缩短为1 h；(6)接种P0细胞到6孔板、长满后传至10 cm培养皿进行P1代VSMC培养。这样的接种密度可以使得VSMC维持较好的增殖速率。经过这些改进，可在2周左右获得百万量的P1代收缩型VSMC、P2代时纯度高达95%以上。

我们在摸索过程发现，确保所分离的VSMC活力的关键是维持中膜层的完整。在剥离外膜时，动作要轻柔；在刮除内膜时，用力要均匀，一般两次刮除就足够了。过多刮除会损坏中膜层，降低细胞产量和活力。使用我们建立的复合酶配方及其作用条件进行初步酶消化，可适当降解内外膜组织间的蛋白成分、使得内外膜的去除轻松易行，对中膜层的损伤大为降低。二步消化的设计不仅可以较好地消除内外膜中其它细胞成分的污染、提高分离的VSMC细胞纯度，还可以大大缩短制备VSMC的时间[5,19]。

有研究者发现，以组织块贴壁法制备VSMC虽然所获得的细胞数量较多，但多为合成型表型；而采用酶消化法制备的VSMC则保留了收缩型表型[3,13，14]。为了确定使用我们的改良方法所分离的细胞的表型，我们考察了P2-P4代细胞中多个收缩型表型分子标记基因及收缩表型调控转录因子的RNA和蛋白表达情形，证实细胞均高水平地表达这些标记基因。进一步分析传至P8代的细胞，我们确定典型的收缩型VSMC分子标记和调控转录因子的表达水平随培养时间增长而下降，尤其是myosin-II这一分子标记，其RNA水平的降低幅度远超α-SMA基因，是较α-SMA更为准确的SMC分子标记。因此，使用我们改良的方法可分离制备高纯度的收缩型大鼠VSMC。

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Preparation of rat thoracic aortic vascular smooth muscle cells bymodified enzyme double digestion

ZHOU Yue-hua1, 2， LIU Xing1, 2， ZHANG Yan-jun1, 2， WANG Xin1, 2， CHEN Yu-ping1, 2*

(1.Key Lab for Advanced Technologies of Materials, Ministry of Education, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China；2.School of Materials Science And Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031)

Objective This paper reports a modified method for the isolation of rat thoracic aortic vascular smooth muscle cells based on combined enzyme double digestion. Methods An enzyme mixture containing collagenase II, soybean trypsin inhibitor and elastase was prepared and used to remove the aortic tunica intima and tunica adventitia, and then the tunica media was subjected to second digestion using the same enzyme mixture and to isolate vascular smooth muscle cells. Results The isolated VSMCs were cultured in vitro and the growing cells had an elongated spindle-shape, reached confluence within a week, and displaying a typical "hill-and-valley" pattern. After 1 week, the cells were passaged. Contractile smooth muscle markers(α-SMA, myosin-II and β-tubulin) were highly expressed in the isolated cells. More than 90% of the cells significantly expressed alpha smooth muscle actin and myosin-II. Conclusions Themethod established in this study has advantages of simple and easy to operate, and good reproducibility, with a high activity and purity of the separated cells. It can ensure to obtain a large amount of contraction-type vascular smooth muscle cells within a short time.

Vascular smooth muscle cells; Complex enzyme; Two step digestion

国家自然科学基金(编号：81371675，81330031)。

周玥华(1990-)，女，硕士研究生，专业：材料工程。Email: 734173594@qq.com

陈渝萍(1970-)，女，教授。Email: yupingc@home.swjtu.edu.cn

研究报告

A

1671-7856(2017) 07-0017-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.004

2016-12-05