猴B病毒抗体不同检测方法的比对

李晋文，佟 巍，蔡 鹃，向志光，魏 强

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

猴B病毒抗体不同检测方法的比对

李晋文，佟 巍，蔡 鹃，向志光*，魏 强*

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

目的 猴B病毒(monkey B virus，BV)，也称猴疱疹病毒I型(Cercopithecineherpesvirus1)，是重要的人兽共患病原。根据国家标准，猴B病毒作为抗原检测抗体，但由于生物安全问题，抗原制备受到很大限制，因此使用替代抗原进行抗体血清学检测并进行比对验证。方法 应用2种ELISA方法(抗原分别为BV和HVP2)和1种免疫酶法EIA方法(抗原为HSV-1)对本实验室135份送检恒河猴血液样品进行筛查，对阳性及可疑样品再以免疫荧光法IFA和Western blot方法(抗原为HSV-1)以及以HSV-1 gC1纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法验证。结果 HVP2-ELISA、BV-ELISA和HSV-1-EIA阳性检出率分别为32.6%、37.8%和34.8%；3种方法检测结果一致的样品占91.1%(123/135)，阳性结果可被IFA和WB确证；可疑样品12份，33.3%(4/12)的样品经验证检验为阳性。结论 与BV抗原相比，替代抗原HSV-1的敏感性和特异性较HVP2更为接近；阳性样品及可疑样品的确证检验应使用多种方法，避免漏检。

猴B病毒；替代抗原；HSV-1；HVP2；ELISA；EIA；IFA；WB

猴B病毒属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，单纯疱疹病毒属。猴B病毒自然宿主为亚洲猕猴，如恒河猴、食蟹猴和豚尾猴等[1，2]，动物自然感染一般无明显的临床表现，病毒感染后多潜伏在神经组织[2]。然而病毒感染人后，可以导致脑炎、脑脊髓炎等严重的中枢神经系统感染症状，甚至死亡[3，4]。因此猴B病毒是非人灵长类动物使用中必须排除的烈性病原体[5]。快速准确地检测猴B病毒对建立高质量的实验猴群以及对高危人群进行防护都有着非常重大的意义。

猴B病毒的检测多采用血清学方法，但由于猴B病毒属于一类病原，必须在生物安全四级(biosafety level 4，BSL-4)实验设施操作，从生物安全的角度考虑出发，目前国内外多用与B病毒具有交叉抗原的替代病毒抗原检测B病毒抗体。也有科学家利用重组抗原进行BV血清学检测[6-8]，但国内外常用HSV-1、HVP2等作为抗原检测猴B病毒[9-12]。

本实验室BV常用的检测方法包括ELISA(抗原分别为BV和HVP2)，免疫酶法 (EIA)和，免疫荧光法 (IFA)(抗原为HSV-1)，Western Blot方法以及以HSV-1 gC1纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法，本文将应用这些方法测试我单位近期送检的135份样品，对以上检测方法进行比对。

1 材料和方法

1.1 恒河猴样本血清

HSV-1(ATCC VR-539)病毒抗原的制备参考既往方法[5]。恒河猴血清样品送检时间为2014年12月 ～ 2016年6月，本室保存。质控阳性血清为既往20份BV阳性血清的混合物，这些血清排除了猴免疫缺陷病毒、猴逆转D型病毒、猴T细胞趋向性病毒Ⅰ型和猴痘病毒抗体的存在[5]。质控阴性血清为20份BV阴性血清混合物，同样排除其他病原抗体。

1.2 HSV-1病毒抗原和EIA、IFA、Western blot方法

HSV-1病毒抗原的制备和HSV-1-WB方法[13]的参考既往方法，调整如下：抗原蛋白上样量20 μg/道，恒河猴血清样品稀释比例为1∶100，二抗为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的兔抗猴IgG抗体。

IFA和EIA方法检测参考本实验室既往方法[5]。

1.3 酶联免疫吸附法

猴ELISA-BV(珠海海泰)和ELISA-HVP2(苏州西山，VRA China)为市售商品试剂。ELISA-HVP2结果判定方法为：样品OD值≥0.3，为阳性；样品OD值<0.3，为阴性；同时为保证实验结果可靠性，对于OD值在0.25 ～ 0.35之间的样本，建议复检或其他方法进一步复证。ELISA-BV结果判定方法为：样品OD值>临界对照OD均值×1.15，为阳性；临界对照OD均值×0.85≤样品OD值≤临界对照OD均值×1.15，为可疑；样品OD值<临界对照OD均值×0.85，为阴性。实验室使用时ELISA-HVP2(苏州西山，VRA China)判断标准进行了调整，阳性样品判定标准调整为：阳性：样品OD值>0.25；阴性：样品OD值<0.35，；可疑：0.25≤样品OD值≤0.35。

1.4 HSV-1 gC1纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法

亲和层析纯化的HSV-1糖蛋白C1(欧蒙医学诊断有限公司，EUROIMMUN)用于免疫印迹检测，为适应猴血清样品检测作以下调整：酶结合物改为HRP标记的兔抗猴IgG抗体(稀释比例为1∶10000)；通用缓冲液清洗5次后，经ECL曝光显影。

2 结果

2.1 HSV-1病毒蛋白经SDS-PAGE展示可显示血清样品中抗病毒抗体特异结合

经差速离心分离的HSV-1病毒经超声处理后与含SDS的上样缓冲液混合处理进行凝胶电泳，并转移至NC膜上。和B病毒抗体阴性的恒河猴血清共孵育无特异条带(图A，N泳道)；和B病毒抗体阳性的恒河猴血清共孵育显示出特异条带(图A，P泳道)，包括分子量115 kDa、分子量65 kDa和分子量58 kDa的条带，符合猴B病毒糖蛋白gB、gC和gD的分子量大小，和文献报道一致[14]。

2.2 初筛检测方法的比较

用HVP2-ELISA方法、BV-ELISA方法和HSV-l-EIA方法三种检测方法对135份恒河猴血清进行检测，阳性率分别为32.6%(44/135)、 37.8%(51/135)、34.8%(47/135)。3种方法检测结果一致的样品占91.1%(123/135)，其中，阳性样品结果一致的有42份，阴性样品结果一致的有81份。而三种检测方法结果不一致的样品11份；三种方法均判定为可疑的样品1份。因此，三种方法每一种均不能完全覆盖其他样品的阳性检出范围。

随后，我们对阳性样品和可疑样品进行了后续验证检验。

2.3 可疑血清样品的判定

以上三种检测方法结果一致的阴性样品81份，阳性样品42份，所有结果可被HSV-1 IFA、HSV-1 WB和HSV-1 gC1纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法确证。其余8.9%(12/135)为可疑阳性样品包括： 1份可疑样品，三种检测方法初筛为可疑样品，经多种方法确证为阴性；11份三种检测结果不一致的样品，其中，HVP2 ELISA和BV ELISA方法检测结果不一致的样品有7份，经HSV-1 IFA、HSV-1 WB(图1B)和HSV-1 gC1纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法确证，3份样品被判定为阳性，4份样品被判定为阴性(如表1所示)。然而，其中2和7号样品仅经BV-ELISA判定为阳性，经多种验证方法均无法确证为阳性，因此推测BV-ELISA方法检测猴B病毒抗体并不完全可靠。此外，对HSV-1 EIA与BV ELISA方法比较，检测结果不一致的其余3份样品也进行了确证，1份样品被判定为阳性，2份样品被判定为阴性。因此，可疑样品的验证检验的阳性率为33.3%(4/12)。

表1 HSV-1 IFA、HSV-l WB和HSV-1 gC1免疫印迹方法确证结果Tab.1 Confirmation results of HSV-1 IFA，HSV-l WB and HSV-1gC1 immunoblotting

注：UN表示无法做出阳性或阴性判定的可疑样品；带“*”的样品是被验证为阳性的样品。

Note. UN indicates the suspicious samples that can not be qualitified; The samples marked with“*” are confirmed as positive.

注：A：猴B病毒阳性对照和阴性对照抗血清和仙台病毒抗原杂交结果。杂交使用预染分子量标准(sm0671，Fermentas)。图中N为阴性对照血清，P为阳性对照血清。B：待检可疑样品免疫印记结果。1～7道依次为编号1 ～ 7检测样品。图1 猴B病毒Western blot检测结果Note. A: Hybridization results of monkey BV positive serum and negative serum and Sendai virus antigen. Prestained molecular weight standard was used(sm0671, Fermentas). N: negetive serum; P: positive serum. B: Immunoblot results of suspicious samples. The lines 1～7 indicate the samples to be detected.Fig.1 Results of Western blot detection of the BV samples

3 讨论

病原检测结果的准确性受多方面因素影响包括：抗原的状态、抗原来源以及质控样品以及临界值的判定标准等。EIA和IFA检测方法病毒抗原以细胞感染的状态经丙酮固定、干燥，附着于载玻片； ELISA方法病毒抗原蛋白通过电荷吸附的方式包被；WB方法病毒蛋白抗原通过变性还原成线性表位。每一种检测方法展示的抗原表位可能存在差异，所有判定结果也会有不同。因此在猴B病毒抗体的检测中有必要使用多种方法进行检测。

猴B病毒存在非常高的生物安全风险，目前国内外一般用HSV-1或HVP2等替代抗原检测猴B病毒。而多个实验室比较各种抗原的检测方法，认为使用替代抗原检测存在漏检的可能[15-19]。本文HVP2-ELISA方法阳性检出率为32.6%，检出率低于其他检测方法，可能有漏检的情况发生，适当降低阳性样品的判定标准，将可疑样品判定范围下限值作为阳性判定标准时，三种方法结果较为一致。参考猴B病毒国家标准检测方法，本文BV-ELISA方法由于未设置正常抗原对照，无法排除非特异结合的可能，导致将阴性样品误判为阳性，因此BV-ELISA方法用来监测猴B病毒感染的动物并不完全可靠，还需要经多种检测方法验证。

在疱疹病毒中, 表面糖蛋白在决定细胞趋向性和致病性方面起着重要作用。猴B病毒与HSV-1糖蛋白氨基酸序列一致性平均高达62.5%，依次为gB(79.9%)，gD(57%)，gC(49.9%)，gE(46%)和gG(29.2%)[20]。由于血清抗gE抗体滴度低，而gG一般不能刺激产生抗体，因此gB、gD和gC是引起HSV-1病毒抗原和恒河猴抗血清发生抗原交叉反应的主要成分[14]。其中BV与HSV-1gB的氨基酸序列一致性最高，抗gB抗体出现最早，抗体滴度最高；尽管如此，二者gB构象结构存在明显差异，而相应抗体的产生高度依赖于gB结构构象暴露的抗原表位，因此对于WB实验中展示的HSV-1 gB线性表位，相对于gD检测猴抗血清抗体敏感性较弱[21]。此外，在WB和斑点印记实验中，血清抗gC抗体不能高效识别gC线性表位。所以，恒河猴血清抗gD抗体与HSV-1gD特异结合显示58 kDa分子量大小的蛋白条带是本文WB方法主要的判定依据，gB和gC显示的115 kDa，65 kDa和80 kDa的蛋白条带则作为参考依据，而以HSV-1 gC1为抗原的免疫印迹法仅作为辅助参考的检测方法。在ELISA、IFA和EIA三种方法中由于抗原纯度的限制而对某些感染情况难以判断，但是在WB方法中可以较好的区分非特异杂交的背景和核心抗原条带的杂交，如图B所示的样品，虽然存在一定的非特异背景，但是可以辨识出核心抗原条带的阳性杂交，因此可以判定为BV阳性。

本文通过对本实验室检测体系现有的检测方法进行比较，先使用不同抗原作为检测抗原所建立的ELISA和EIA方法筛查猴B病毒感染动物，再使用WB方法确证，同时联合IFA等其他方法，具有一定的实用价值和意义。而对于任意一种方法检测出的阳性以及可疑阳性样品，采用不同方法以做出诊断，无论对于繁育群体还是研究群体都是有重要意义的。

[1] Estep RD, Messaoudi I, Wong SW. Simian herpesviruses and their risk to humans[J]. Vaccine, 2010, 28(Suppl 2): B78-84.

[2] Elmore D, Eberle R. Monkey B virus (Cercopithecineherpesvirus1)[J]. Comp Med, 2008, 58(1): 11-21.

[3] Tischer BK, Osterrieder N. Herpesviruses—a zoonotic threat?[J]. Vet Microbiol, 2010, 140(3-4): 266-270.

[4] Huff JL, Barry PA. B-virus (Cercopithecineherpesvirus1) infection in humans and macaques: potential for zoonotic disease[J]. Emerg Infect Dis, 2003, 9(2): 246-250.

[5] 国家标准：实验动物微生物学等级及监测，GB14922. 2-2011

[6] Perelygina L, Patrusheva I, Hombaiah S, et al. Production of herpes B virus recombinant glycoproteins and evaluation of their diagnostic potential[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(2): 620-628.

[7] 肖镜，付瑞，贺争鸣，等. 猴B病毒BVgD-多肽ELISA检测方法的建立[J].实验动物科学, 2008, 25(2): 20-23.

[8] 叶华虎，袁菊芳，刘欢，等. 猴B病毒囊膜蛋白gD的B细胞表位预测及鉴定[J].中国比较医学杂志，2014, 24(11): 20-26.

[9] 吴小闲，蒋虹，曲立荣，等. 恒河猴B病毒相关抗体检测方法的比较[J]. 病毒学杂志, 1989, 3(1): 80-84.

[10] 王晓明，王建飞，戚晨伟，等. 恒河猴B病毒感染的初步探讨[J].实验动物与动物实验，1990, (2): 4-6.

[11] Takano J, Narita T, Fujimoto K, et al. Detection of B virus infection in cynomolgus monkeys by ELISA using simian agent 8 as alternative antigen[J]. Exp Anim, 2001, 50(4): 345-347.

[12] Tanaka S, Mannen K, Sato H. Use of herpesvirus papio 2 as an alternative antigen in immunoblotting assay for B virus diagnosis[J]. J Vet Med Sci, 2004, 66(5): 529-532.

[13] 向志光，佟巍，李雨函，等. 大鼠仙台病毒ELISA、间接免疫荧光和免疫印迹三种检测方法比较[J].中国比较医学杂志，2013，23(1): 23-26.

[14] Perelygina L, Patrusheva I, Zurkuhlen H, et al. Characterization of B virus glycoprotein antibodies induced by DNA immunization[J]. Arch Virol, 2002, 147(11): 2057-2073.

[15] 韦毅，符明泰，石寒，等. 三种不同抗原对猴B病毒抗体检测结果的比较研究[J].实验动物科学, 2001, 18(2): 1-3.

[16] 周亚敏，李绍东，杨森富，等. 猴疱疹病毒(B病毒)抗体检测方法的比较研究[J].中国比较医学杂志, 2005, 15(4): 237-239.

[17] 贺争鸣，卫礼，巩薇，等. 猴B病毒抗体ELISA法的建立和应用研究[J].中国实验动物学报, 2003, 11(3): 161-164.

[18] 王晓明，邵伟娟，王建飞. 猴B病毒抗体及B病毒相关抗体ELISA检测结果比较[J].实验动物与比较医学, 1997, 17(2): 80-81.

[19] 李舜，李筱青，蔡标，等. 猕猴血清B病毒抗体3种检测方法的比较[J].动物医学进展, 2012, 33(1): 134-135.

[20] Perelygina L, Zhu L, Zurkuhlen H, et al. Complete sequence and comparative analysis of the genome of herpes B virus (Cercopithecineherpesvirus1) from a rhesus monkey[J]. J Virol, 2003, 77(1): 6167-6177.

[21] Eing BR, Kühn JE, Braun RW. Neutralizing activity of antibodies against the major herpes simplex virus type 1 glycoproteins[J]. J Med Virol, 1989, 27(1): 59-65.

Comparison of different detection methods of monkey B virus antibody

LI Jin-wen， TONG Wei， CAI Juan， XIANG Zhi-guang*， WEI Qiang*

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy Of Medical Sciences；Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)

Objective Monkey B virus(BV), also known asCercopithecineherpesvirus1,is an important zoonotic pathogen. According to the national standard, antibodies are detected using BV as an antigen. However, the preparation of BV antigen is very stricted due to biosafety issues. Therefore, in this study, we used alternative antigens to detect the BV antibody by serological assay and verified their specifity and sensitivity. Methods A total of 135 blood samples from rhesus monkeys were tested by two ELISA method (BV and HVP2) and enzyme immunosorbent assay (EIA)method. The positive and suspicious samples were verified by immuno-fluorescence assay (IFA), Western blot and immunoblotting technique using HSV-1 gC1 purified glycoprotein as an antigen. Results The positive rates of HVP2-ELISA, BV-ELISA and HSV-1-EIA were 32.6%, 37.8% and 34.8%, respectively. Consistant result of the three detection method accounted for 91.1% (123/135), and the positive result were confirmed by IFA And WB.There were 12 suspicious samples,in which 33.3% (4/12) were verified to be positive. Conclusions Compared with BV antigen, the sensitivity and specificity of the alternative antigen HSV-1 are moe close than HVP2. Positive and suspicious samples should be verified by several method to avoid missed detection.

Monkey B virus; Alternative antigen; HSV-1; HVP2; ELISA; Enzyme immunosorbent assay, EIA; Immuno fluorescence assay, IFA; Western blot

协和青年基金(编号：3332015196)和卫计委公益性行业科研专项(编号：201302006)。

李晋文，女，硕士研究生，比较医学。Email: elberra_ljw@163.com

向志光，Email: xiangzg@cnilas.org；魏强，Email: weiqiang0430@sohu.com.*共同通讯

研究报告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0029-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.006

2017-02-13