HMGB1、CD68和D2-40与甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的相关性研究

陆皓东 陈春悠 刘宏飞

华北理工大学口腔医学院 河北唐山 063000;①河北省唐山工人医院头颈外科；②华北理工大学临床医学院

HMGB1、CD68和D2-40与甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的相关性研究

陆皓东 陈春悠①刘宏飞②

华北理工大学口腔医学院 河北唐山 063000;①河北省唐山工人医院头颈外科；②华北理工大学临床医学院

①目的 研究高迁移率族蛋白1(HMGB1)、CD68及D2-40在甲状腺乳头状癌(PTC)中的表达水平以及与PTC颈部淋巴结转移的相关性，为临床判断患者预后提供重要的实验证据。②方法 采用免疫组化SP法检测PTC组织和甲状腺良性肿瘤组织中HMGB1、CD68及D2-40的表达水平。③结果 HMGB1、CD68和D2-40在PTC组织中的表达水平明显高于在甲状腺良性肿瘤组织中的表达水平；在伴颈部淋巴结转移的PTC组织中的表达水平明显高于在未伴颈部淋巴结转移的PTC组织中的表达水平。④结论 HMGB1、CD68及D2-40三者的表达水平在PTC中明显高于在甲状腺良性肿瘤中的表达水平；三者在PTC中的表达水平与年龄、性别均无明显关系，而与有无颈部淋巴结转移有关，因此三者的表达水平之间均呈显著正相关。三者的高表达促进PTC的淋巴结转移，在PTC的发生、发展以及淋巴结转移的过程中扮演了重要的角色。

甲状腺乳头状癌 高迁移率族蛋白1 CD68 D2-40 颈部淋巴结转移

甲状腺癌为人类最常见的头颈部恶性肿瘤之一。其中甲状腺乳头状癌(Papillary Thyroid Carcinoma，PTC)为最常见的甲状腺癌的病理类型。近3年来其相对发病率明显增加，约占甲状腺癌的83%～90%[1]。PTC主要的转移途径即为淋巴道转移，其颈部淋巴结转移对于PTC患者的临床诊断及预后情况的判断具有重大意义。高迁移率族蛋白1(High Mobility Group Box-1，HMGB1)在肿瘤组织内的高表达，不仅影响着血管淋巴管的生成，而且可以激活肿瘤相关巨噬细胞(Tumor Associated Macrophages，TAMs)。TAMs参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移的过程，尤其是与肿瘤血管生成和淋巴管生成密切相关(CD68是TAMs的一种特异性标记物)。而D2-40能够对淋巴管进行特异性的标记，从而使研究者可以判断淋巴管的密度(Lymphatic Vessel Density，LVD)。本研究旨在检测HMGB1、CD68及D2-40在PTC以及甲状腺良性肿瘤组织中的表达情况，探讨PTC中HMGB1、肿瘤相关巨噬细胞与淋巴管密度之间的相关性以及其与PTC颈部淋巴结转移的相关性，为临床判断患者预后提供重要的实验依据[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 本研究选取自2014年1月～2015年12月在河北省唐山工人医院头颈外科接受诊治的93例甲状腺肿瘤患者石蜡包埋的肿瘤组织，所有蜡块均有完整的临床及病理资料。其中PTC共62例，女30例、男32例，年龄18～62岁、平均41.0岁，颈部淋巴结转移情况：有转移31例、无转移31例。甲状腺良性肿瘤31例。所有患者术前均未接受化疗、放疗或激素治疗。

1.1.2 实验试剂 兔抗人HMGB1多克隆抗体、兔抗人CD68多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，鼠抗人D2-40单克隆抗体、DAB试剂盒、Polink-1试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法 采用免疫组化SP法进行染色，具体操作步骤以试剂说明书为准进行操作。以试剂公司提供的阳性切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

1.3.1 HMGB1 HMGB1阳性染色表达为细胞核内黄色或棕黄色颗粒。综合染色强度及阳性细胞百分比进行评分从而判定其表达水平。

1.3.2 CD68 CD68阳性染色表达为巨噬细胞细胞质中黄色或棕黄色颗粒。通过低倍镜(×100)下对整张切片进行观察，从而搜索出其中含CD68数量最高的区域，之后在高倍镜(×400)下随机选取5个视野对其中的阳性细胞进行计数并取其平均值作为其计数值。将所有病例的计数值取平均值作为标准，大于平均值为高表达，小于平均值为低表达。

1.3.3 D2-40 D2-40(LVD)以Weidner标准计数：每个被染成棕色或棕红色的单个内皮细胞或内皮细胞簇为一个淋巴管计数，先在低倍镜(×40)下选取淋巴管高密度的“热区(Hot Spot)”，在高倍镜(×200)下选取5个高倍视野分别对其淋巴管进行计数，取其平均值作为其淋巴管计数。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析处理。连续变量采用独立样本t检验，相关性采用Spearman等级相关分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

HMGB1、CD68和D2-40在PTC组织中的表达水平明显高于在甲状腺良性肿瘤组织中的表达水平(P<0.05)。在PTC组织当中，HMGB1、CD68和D2-40的表达水平与年龄和性别两项临床特征无关(P>0.05)，而三者的表达水平与有无淋巴结转移有明显的关系(P<0.05)。经过Spearman相关性分析可以发现，HMGB1、CD68和D2-40表达水平之间有显著的相关性，三者呈正相关(P<0.05)。

表1 HMGB1、CD68和D2-40的表达

表2 HMGB1、CD68和D2-40在PTC中的表达与临床特征的关系

表3 HMGB1、CD68和D2-40的相关关系(r)

3 讨论

相比其发生与发展，PTC的颈部淋巴结转移无论在国内还是国外学术界都是一个相对来说较少被提及的话题，而其对于PTC患者的临床诊断及预后情况却具有重大意义。随着研究的不断深入，国内外不断有研究指出，HMGB1在肿瘤的发生、发展中扮演了不可或缺的角色，其通过与肿瘤相关巨噬细胞相互作用，促进肿瘤内血管及淋巴管的生长，从而为癌细胞通过淋巴道转移提供了更高的可能性。因缺乏淋巴管的特异性标记，以前的研究从形态学的角度难以准确地区分血管和淋巴管，阻碍了肿瘤淋巴管的研究，对甲状腺肿瘤的研究也多集中在血管生成领域。而随着特异性淋巴管内皮标志物D2-40的发现，肿瘤淋巴管的研究迎来了一个新的飞跃：我们在研究中通过染色的程度，可以准确的判断出淋巴管，从而对其进行计数以判断其密度。尽管目前对于HMGB1已经有了较为深入的研究，对于肿瘤相关巨噬细胞及淋巴管密度的研究也突飞猛进，但是对于甲状腺癌肿瘤领域，尤其是关于淋巴结转移过程中HMGB1及肿瘤相关巨噬细胞的作用机制仍有待进一步的探讨，对于淋巴管密度在甲状腺肿瘤组织中的情况与淋巴结转移的关系仍不明确。

HMGB1是真核细胞核内一类较为丰富的非组蛋白染色质蛋白。有研究分析HMGB1参与肿瘤发生、发展的机制可能包括两方面：其一HMGB1的过表达引起某些基因表达失调继而导致肿瘤发生；其二HMGB1的过表达可使获得肿瘤表型的细胞免于凋亡，从而导致肿瘤发生。目前认为，HMGB1可能通过与其配体RAGE结合，激活一些因子的信号通路，其中包括MAPK、Rac1、NF-κB、细胞外信号调节蛋白激酶(Extra Cellular Signal Regulated Kinase，ERK)1/2及蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB)等，进而激活MMP-2、MMP-9等，从而作用于细胞外基质使其降解，促使肿瘤浸润和转移[3]。本研究结果表明，HMGB1在PTC组中的阳性率为61.3%，明显高于其在甲状腺良性肿瘤组中的阳性率22.6%，二者差异有统计学意义(P<0.05)；而在PTC组中，HMGB1在不同年龄以及不同性别分组之间的表达水平无明显差异(P>0.05)，但是其在有淋巴结转移组的阳性率(80.65%)明显高于在无淋巴结转移组的阳性率(41.94%)，二者差异有显著的统计学意义(P<0.001)；经过Spearman相关性分析，HMGB1的表达水平与CD68以及D2-40的表达水平均呈显著的正相关(P<0.005)。这说明HMGB1的高表达能够促使TAMs增殖以及淋巴管的生长，从而在PTC的发生、发展以及淋巴结转移过程中起到重要的作用。

以往的研究认为，TAMs发挥着抗肿瘤的作用。但是近年来的研究逐渐认识到，事实并非如此。这些肿瘤间质中的巨噬细胞参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移的过程。因此，研究TAMs在肿瘤进程中的功能状态和动态变化具有重要意义，研究TAMs也需要一种特异性标记物，即为CD68。TAMs参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移的过程，尤其是与肿瘤血管生成和淋巴管生成密切相关：TAMs主要通过分泌VEGF、PDGF、HGF、bFGF和TGF-β等生长因子来促进肿瘤细胞增殖和存活[4]，通过上调一些因子的表达，如蛋白水解酶(如组织蛋白酶B)、MMP、纤溶酶、uPA及其受体等，引起基底膜的破坏，从而导致细胞外基质的溶解，从而增强肿瘤细胞的侵袭性。TAMs也能表达VEGF-C、VEGF-D及其受体VEGFR-3，导致瘤周淋巴管生成，进而导致转移的发生[5]。本次研究结果表明，CD68在PTC组中的阳性率为71.0%，明显高于其在甲状腺良性肿瘤组中的阳性率(16.1%)，二者差异有显著的统计学意义(P<0.001)；而在PTC组中，CD68在不同年龄以及不同性别分组之间的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，但是其在有淋巴结转移组的阳性率(87.10%)明显高于在无淋巴结转移组的阳性率(54.84%)，二者差异有统计学意义(P<0.01)；经过Spearman相关性分析，CD68的表达水平与D2-40的表达水平均呈明显的正相关(P<0.005)。以上实验结果表明，TAMs不仅参与了PTC的发生和发展，还能促使肿瘤中淋巴管生长增殖，从而参与到PTC的淋巴转移过程中，其在肿瘤的生长过程中扮演了重要的角色。

长期以来，临床病理学的观点普遍认为淋巴管为肿瘤细胞的播散提供了通道，是恶性肿瘤转移的一个关键因素。而随着特异性淋巴管内皮标志物的发现，研究甲状腺癌淋巴管侵袭扩散和肿瘤淋巴管生长之间的关系成为可能[6]。D2-40能特异性标记淋巴管，而不标记血管，从而能够准确的判断组织内淋巴管密度的水平，因此填补了鉴别脉管性肿瘤的起源及判断肿瘤转移途径等方面研究的空白。本次研究结果显示，在PTC中，LVD的水平(12.45±6.29)远高于甲状腺良性肿瘤中LVD的水平(3.58±3.11)，二者差异具有显著的统计学意义(P<0.001)；而在不同年龄分组以及不同性别分组中，LVD的水平并未显示出有明显的统计学差异(P>0.05)；而经过Spearman相关性分析后可以发现，HMGB1、CD68与LVD的水平均成显著的正相关(P<0.001)。这表明PTC组织中淋巴管数量的水平与PTC的淋巴结转移具有着密不可分的关系，而HMGB1和CD68相互作用，促进了淋巴管的增殖从而影响着PTC的淋巴结转移。

综上所述，本次研究表明了HMGB1、CD68以及D2-40三者在PTC的发生、发展以及淋巴结转移的过程中扮演了重要的角色。三者的表达水平在PTC中明显高于在甲状腺良性肿瘤中的表达水平；三者在PTC中的表达水平，与年龄、性别均无明显关系，而与有无颈部淋巴结转移有着密切联系，因此三者的表达水平之间均呈显著的正相关。HMGB1在肿瘤生长过程中，不仅激活TAMs，而且直接参与到淋巴管形成的过程中；TAMs促进肿瘤细胞的增殖以及淋巴管的发生和增殖；而经过HMGB1和TAMs的共同作用后，肿瘤组织中淋巴管数量增多，直接参与并促进了PTC的颈部淋巴结转移。

[1] Wells Samuel A. Jr,Asa Sylvia L,Dralle Henning,et al.The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Medullary Thyroid Carcinoma[J].Thyroid,2015,25(6):567-610

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[3] 曹清心,刘 宇,凌昌全.HMGB1与肿瘤相关性的研究进展[J].临床肿瘤学杂志,2012,17(3):282-285

[4] Laure Gibot,Todd Galbraith,Bryan Kloos,et al.Cell-based approach for 3D reconstruction of lymphatic capillaries in vitro reveals distinct functions of HGF and VEGF-C in lymphangiogenesis[J].Biomaterials,2016,78:129-139

[5] 吴 婷,周武雄.肿瘤相关巨噬细胞的极化与肿瘤的发展[J].现代肿瘤医学,2015,23(12):1753-1756

[6] Lee SH,Lee SJ,Jin SM,et al.Relationships between lymph node metastasis and expression of CD31, D2-40,and vascular endothelial growth factors A and C in papillary thyroid cancer[J].Clin Exp Otorhinolaryngol,2012,5(3):150-155

(2017-01-09 收稿)(库雪飞 编辑)

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The relationship among HMGB1,CD68,D2-40 and cervical lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma

LU Haodong,CHEN Chunyou,LIU Hongfei

(Oral Medical School,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China)

Objective To study the expression levels of HMGB1,CD68 and D2-40 in papillary thyroid carcinoma and their correlation with the cervical lymph node metastasis in thyroid papillary carcinoma,for the clinical judgment of patients with prognosis to provide important experimental evidence.Methods To detected the expression levels of HMGB1,CD68 and D2-40 in thyroid papillary carcinoma and thyroid benign tumor tissues.Results The expression levels of HMGB1,CD68 and D2-40 in papillary thyroid carcinoma tissues were significantly higher than their expression levels in thyroid benign tumor tissues.Their expression levels in the tissues of thyroid papillary carcinoma with cervical lymph node metastasis were significantly higher than those in the tissues of papillary thyroid carcinoma without cervical lymph node metastasis.Conclusion The expression levels of HMGB1,CD68 and D2-40 are positively correlated in papillary thyroid carcinoma.High expression levels promote the lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.It is of great significance for the clinical diagnosis and treatment of papillary thyroid carcinoma.

Papillary thyroid carcinoma.HMGB1.CD68.D2-40.Cervical lymph node metastasis.

陆皓东(1989-)，男，硕士研究生。研究方向：口腔颌面外科及头颈部肿瘤。

陈春悠。

R 581

A

2095-2694(2017)04-272-05