MCM7、SKP2和P27蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及其临床意义

刘宏飞 陈春悠 陆皓东

华北理工大学研究生学院 河北唐山 063000;①唐山工人医院头颈外科;②华北理工大学口腔医学院

MCM7、SKP2和P27蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及其临床意义

刘宏飞 陈春悠①陆皓东②

华北理工大学研究生学院 河北唐山 063000;①唐山工人医院头颈外科;②华北理工大学口腔医学院

①目的 探讨微小染色体维持蛋白7(Minichromosome maintenance protein7，MCM7)、S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein 2，SKP2)和细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白P27(cyclin dependent kinase inhibited protein，P27)在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)中的表达及其临床病理特征之间的关系。②方法 采用免疫组织化学S-P法检测MCM7、SKP2和P27蛋白在50例甲状腺乳头状癌、30例结节性甲状腺肿、30例甲状腺腺瘤及20例正常甲状腺组织中的表达。③结果 甲状腺乳头状癌组织中MCM7、SKP2蛋白的阳性表达率均显著高于结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤及正常甲状腺组织。甲状腺乳头状癌中P27蛋白的阳性表达率显著低于结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤及正常甲状腺组织。MCM7与P27蛋白的表达、SKP2与P27蛋白的表达均呈负相关。④结论 MCM7、SKP2及P27蛋白与甲状腺乳头状癌的发生和发展起着重要的作用，且MCM7、SKP2蛋白对于淋巴结有无转移方面可能有鉴别意义。在临床上将MCM7、SKP2及P27蛋白联合检测，对于提高术前诊断的准确性及判断淋巴结的转移情况可能有一定的作用。

甲状腺乳头状癌 MCM7蛋白 SKP2蛋白 P27蛋白

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤[1]，其主要组织学类型为甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer，PTC)，约占85%。肿瘤的发生与细胞周期密切相关，尤其是G1期向S期的过渡期，起着十分重要的作用。本研究采用免疫组化S-P法检测G1向S期过渡时细胞周期调控因子微小染色体维持蛋白(MCM7)、S期激酶相关蛋白(SKP2)及细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白P27(P27)蛋白在PTC中的表达及其与PTC临床病理特征之间的关系，从而探讨三者在PTC中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集工人医院病理科2014年6月～2015年12月间经外科手术切除的甲状腺病变组织130例，所有病例在术前均未经过放疗、化疗等辅助治疗，且病案资料完整。

收集的标本按照WHO甲状腺肿瘤的分类标准进行分类。其中PTC50例，结节性甲状腺肿30例，甲状腺腺瘤30例，正常甲状腺组织20例。正常组织选取结节性甲状腺肿周围1cm以外的组织。50例PTC组中：女41例，男9例；≥45岁者14例，<45岁者36例；肿瘤直径>1cm者17例，≤1cm者33例；单发病灶者37例，多发病灶13例；有淋巴结转移者35例，无淋巴结转移者15例。

1.2 主要试剂 兔抗人MCM7多抗；兔抗人SKP2多抗；兔抗人P27多抗。均购自北京博奥森生物科技有限公司。

1.3 方法 采用Evision免疫组化法，按试剂盒说明书进行实验步骤，用已知的胃癌MCM7阳性切片、已知的肝癌SKP2阳性切片以及已知的喉癌P27阳性切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定 参考Bukholm[2]、许良中[3]等人的标准进行结果判定：由2位经验丰富的病理科医师在不知情的情况下，每张切片在高倍镜下(400倍)随机选择5个视野分析，每个视野至少计数100个细胞，取其平均值。3种蛋白阳性表达计数均根据细胞核着色情况对染色强度进行评估分级，即：未着色为0分；浅棕色为1分；棕色为2分；深棕色为3分。同时根据阳性细胞的百分率分为5级：阳性细胞数占9%以下为0分，阳性细胞10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～74%为3分，>75%为4分。每一病例的染色强度与阳性细胞数乘积0分者为(-)，指不表达;1～3分者为(+)，低表达;4～8分者为()，中度表达；9～12分者为()，强表达。0分为表达阴性，1～12分为表达阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件对数据进行χ2检验以及spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 不同甲状腺组织中MCM7、SKP2及P27蛋白的阳性数及阳性表达率比较 PTC中MCM7、SKP2蛋白的阳性表达率分别为72%(36/50)、70%(35/50)，明显高于结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤及正常甲状腺组织。PTC中P27蛋白的阳性表达率为14%(7/50)，明显低于结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤及正常甲状腺组织。三者在PTC组与结节性甲状腺组、PTC组与甲状腺腺瘤组、PTC组与正常组织之间的蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 PTC中MCM7、SKP2及P27蛋白与临床病理参数之间的关系 PTC中MCM7、SKP2蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤直径及病灶数之间的阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与淋巴结转移的阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。PTC中P27蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤直径、病灶数及淋巴结转移的阳性表达率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 PTC中MCM7、SKP2与P27蛋白表达之间的相互关系 PTC中MCM7、SKP2与P27蛋白的表达均呈负相关(r1=-0.323，P<0.05;r2=-0.302，P<0.05)，见表3。

表1 不同甲状腺组织中MCM7、SKP2及P27蛋白阳性数及表达率的比较

注：*PTC组与结节性甲状腺肿组间比较， **PTC组与腺瘤组比较， ***PTC组与正常组间比较

表2 PTC中MCM7、SKP2、P27蛋白表达与临床病理参数的比较

表3 PTC中P27与MCM7、SKP2蛋白表达之间的相关性

注：r1=-0.323;r2=-0.302

3 讨论

由细胞周期失调引起的异常细胞增殖是肿瘤发生的基础[4]。G1早期,MCMs、起始识别复合物(oringin recognization complex,ORC)、细胞分裂蛋白6(CDC6)等复制起始因子与复制子有序的结合,形成前复制复合体(pre-RC);G1期到S期,经CDC7/DBF4激活pre-RC后再活化MCMs,激活的MCMs具有DNA解链酶活性,最终启动DNA复制[5]。MCM7决定染色体复制能力的大小，正常细胞中MCMs蛋白的表达在G1/S转换时达峰值,在Go期细胞和分化、衰老的细胞中,MCMs蛋白表达水平下降。因此,MCMs蛋白的水平随细胞增殖、生长能力的增强而升高[6]。P27被认为是一种肿瘤抑制基因,作为细胞周期的负性调控因子参与细胞周期调控,抑制细胞的恶性转化及异常增殖、分化,延缓恶性肿瘤的进程[7]。MCM7的保守结构域与P27基因的羧基末端结构域相结合后,使DNA的复制受抑,诱导细胞停止于G1期,说明P27可以负性调控MCM7。在细胞周期中,若存在P27的表达下调,将有可能导致MCM7的表达上调,从而可以过度发挥其在DNA复制期间的作用,促进肿瘤的发生[8]。SKP2是细胞从G1期进入S期的必需因子，主要通过泛素蛋白酶体途径(UPP)来参与细胞周期调控因子的降解，P27即是主要通过此途径造成从G1期开始被SKP2泛素化降解，表达下调,使P27对细胞周期的抑制作用减弱,细胞不断增殖,最终导致肿瘤形成[9]。

近年来，国内外大量研究表明，MCM7、SKP2及P27蛋白与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。但未见三者联合报道。Choy B[10]等证实MCM4，MCM7和Ki-67表达的平均百分比从鳞状上皮增加到柱状细胞化生，Barrett食管，高度异型增生，腺癌，低级别发育不良和鳞状细胞癌显著增高，且MCM4和MCM7表达的百分比显著高于Ki-67表达。此外该文章还证实MCM4和MCM7表达的百分比将与食管癌和癌前病变中的Ki-67，Bmi1和细胞周期蛋白E表达显著相关。MCM4和MCM7可以作为更敏感的增殖标记物用于评估食管的损伤。国内陈军[11]等采用免疫组化法检测MCM7和P27在胃癌组织中的表达及其意义，结果显示：MCM7 和P27 蛋白在正常胃黏膜、低级别非典型增生和胃癌组织中的表达之间差异有统计学意义；且胃癌组织中MCM7和P27蛋白的标记指数表达呈显著负相关。说明MCM7蛋白的高表达和P27蛋白的低表达与胃癌的发生及发展密切相关, 检测MCM7和P27蛋白有助于判断胃癌恶性程度及预后。叶劲军等[12]采用免疫组化法检测SKP2和P27蛋白在食管癌和癌旁组织中的阳性表达率，差异有统计学意义。且SKP2、P27蛋白表达呈负相关关系。证明SKP2和P27参与正常食管组织向食管癌的演变，可能与食管癌的发生和发展有关。任占平[13]等采用免疫组化法检测MCM7及P27蛋白在正常子宫内膜、内膜增生、非典型性增生到子宫内膜样腺癌组织中的阳性表达水平，P27呈逐渐下降趋势;而MCM7阳性表达水平呈逐渐上升趋势。子宫内膜样腺癌组中P27与MCM7蛋白的表达呈负相关,P27蛋白低表达与组织学分级及手术病理分期有关，MCM7蛋白的高表达与组织学分级、肌层浸润、淋巴结转移和手术病理分期有关;P27低表达和MCM7的高表达与肿瘤的复发有关。P27蛋白的表达缺失和MCM7的高表达可能涉及子宫内膜样腺癌的发生、发展过程, 两者的联合检测可作为临床早期诊断、评价预后的生物学指标。本实验结果总体与前人的研究结论相似，但由于样本量有限，且未能对PTC进行TNM分期的比较，需进一步做大样本实验进行分析比较。

本实验结果显示：PTC组织中MCM7、SKP2蛋白的阳性表达率均显著高于结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤及正常甲状腺组织。PTC中P27蛋白的阳性表达率显著低于结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤及正常甲状腺组织。三者在PTC组与结节性甲状腺组、PTC组与甲状腺腺瘤组、PTC组与正常组织之间的蛋白表达均存在明显的差异性。该结论说明MCM7、SKP2蛋白的高表达以及P27蛋白的低表达与PTC的发生、发展过程有关。另外本研究还发现MCM7、SKP2蛋白与PTC中淋巴结的阳性表达率比较，差异有统计学意义，说明二者在评估PTC患者有无淋巴结转移情况中可能有鉴别意义。此外，本研究还发现MCM7与P27蛋白的表达、SKP2与P27蛋白的表达均呈负相关。表明MCM7及SKP2蛋白在PTC的发生、发展中行使正性调控作用，且二者可能是通过降解或下调P27蛋白来发挥其促肿瘤作用。

总之，MCM7、SKP2及P27蛋白在PTC的发生、发展中起着重要的作用，且MCM7、SKP2蛋白对于淋巴结有无转移方面可能有鉴别意义。在临床上将MCM7、SKP2及P27蛋白联合检测，对于提高术前诊断的准确性及判断淋巴结的转移情况方面可能有一定的作用。

[1] Farrokhi Y R,Rezaie T M,Arefi O A,et al.The metabolomics and lipidomics window into thyroid cancer research[J].Biomarkers Biochemical Indicators of Exposure Response & Susceptibility to Chemicals,2016:1-19

[2] Bukholm I R,Bukholm G,Holm R,et al.Association between histology grade,expression of HsMCM2,and cyclin A in human invasive breast carcinoma[J].J Clin pathol,2003,56(5):368-373

[3] 许良中,杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准[J].中国癌症杂志, 1996，6(4):229-231

[4] Gambichler T,Bischoff S,Bechara F G,et al.Expression of proliferation markers and cell cycle regulators in T cell lymphoproliferative skin disorders[J].Journal of Dermatological Science,2008,49(2):125-132

[5] Aparicio T,Megias D,Mendez J.Visualization of the MCM DNA helicase at replication factories before the onset of DNA synthesis[J].Chromosoma，2012,121(5):499-507

[6] Aparicio T,Megias D,Mendez J.Visualization of the MCM DNA helicase at replication factories before the onset of DNA synthesis[J].Chromosoma,2012,121(5):499-507

[7] 柴大敏,鲍正齐,胡建国,等.喉鳞状细胞癌中细胞周期蛋白E和p27异常表达的临床意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2014(3):165-169

[8] 林海瑞.MCM7、Skp2、p27、Rb在子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌中的表达及意义[D].天津：天津医科大学,2014

[9] 罗四维,彭先兵,张 群,等.Skp2结构与肿瘤关系研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2010,24(2):110-112

[10] Choy B,Lalonde A,Que J,et al.MCM4 and MCM7,Potential novel proliferation markers,significantly correlated with Ki67,Bmi1,and Cyclin E expression in esophageal adenocarcinoma,squamous cell carcinoma,and precancerous lesions[J].Human Pathology,2016,57:126-135

[11] 陈 军,曹 骥,覃思繁.胃癌组织MCM7和p27蛋白表达及其临床意义的探讨[J].中华肿瘤防治杂志,2010,17(21):1755-1757

[12] 叶劲军,费春明,周国仁,等.食管癌组织中Skp2和p27的表达及临床意义[J].临床肿瘤学杂志,2015,(7):615-619

[13] 任占平,石 喆,张 芫.子宫内膜样腺癌组织中p27、MCM7蛋白的表达及意义[J].肿瘤防治研究, 2011,38(1):73-76

(2017-01-09 收稿)(库雪飞 编辑)

The expression and significance of MCM7、SKP2 and P27 in papillary thyroid carcinoma

LIU Hongfei,CHEN Chunyou,LU Haodong

(North China University of Science and Technology,Tangshan 063000, China)

Objective To explore the expression and significance of MCM7、SKP2 and P27 protein in papillary thyroid carcinoma.Method Detected 50 cases of PTC patients,30 cases of thyroid nodular goiter patients,30 cases of thyroid adenoma patients and 20 cases of normal thyroid patients with immunohistochemical SP method.Results The positive expression rate of MCM7、SKP2 protein in PTC patients were significantly higher than those of thyroid nodular goiter patients,thyroid adenoma patients and normal thyroid patients.The positive expression of P27 protein in papillary thyroid carcinoma patients was significantly lower than those of nodular goiter patients,thyroid adenoma patients and normal thyroid patients.The expression level of P27 protein was negatively correlated with MCM7 and SKP2 protein in papillary thyroid carcinoma patients.Conclusion MCM7,SKP2 and P27 protein play an important role in the development and progression of papillary thyroid carcinoma.MCM7 and SKP2 protein have unique significance in lymph node metastasis. Clinically, the combination of MCM7, SKP2 and P27 protein can improve the accuracy of preoperative diagnosis and determine the lymph node metastasis.

Papillary thyroid carcinoma.MCM7 protein.SKP2 protein.P27 protein

刘宏飞(1990-)，女，硕士研究生。研究方向：头颈部肿瘤。

陈春悠。

R 581

A

2095-2694(2017)04-295-05