奶牛乳房炎早期诊断试剂盒判定标准的制定

文/周庆民 徐 馨＊ 冯万宇 张 艳 宁秀云

奶牛乳房炎早期诊断试剂盒判定标准的制定

文/周庆民1徐 馨1＊冯万宇1张 艳1宁秀云2

（1黑龙江省兽医科学研究所；2 讷河市动物防疫站）

为了建立奶牛乳房炎早期诊断试剂盒的判定标准，以目前检测奶牛是否患有乳房炎最为准确的显微镜直接计数法为设定标准依据，以染色深浅与体细胞中DNA含量多少成正比、DNA含量多少与体细胞数量成正比的数量关系做对比，制定奶牛乳房炎早期诊断试剂盒的判定标准。结果显示，该试剂盒判定结果能够准确反映体细胞数量变化区间，准确判别奶牛乳房炎发生的程度。该试剂盒判定标准准确、划分区间细致，能够以明确的颜色变化准确快速判别奶牛乳房的状况。

奶牛乳房炎；诊断试剂盒；DNA裂解；显微镜计数；判定标准

奶牛乳房炎是奶牛生产中发病率高、发生广泛、危害最严重、造成损失最大的疾病之一，危及人类食品安全，严重阻碍奶牛业的健康发展。针对奶牛乳房炎早期临床症状不明显，呈隐性发生，不易判断，研制出了奶牛乳房炎早期诊断试剂盒，其具有反应快速、检测便捷的特点。本试验以目前检测奶牛是否患乳房炎最为准确的直接显微镜细胞计数法为设定标准依据，以染色颜色深浅与体细胞中DNA含量多少成正比、DNA含量多少与体细胞数量成正比的数量关系做对比，检验本试剂盒的判定准确性，同时制订其判定标准。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

乳汁：采自齐梅生物科技股份有限公司良种乳牛繁育基地。

试剂：甲基绿（广州威佳科技有限公司）、碘化钾（济南嘉裕化工有限公司）、冰醋酸（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）、醋酸钠（南方医科大学试剂中心）。

1.2 试验方法

1.2.1 采集乳样

随机在齐梅生物科技股份有限公司良种乳牛繁育基地选取奶牛50 头，选用专用的奶牛乳头药浴液，对乳头进行药浴，药液作用时间保持在20～30 s。药浴后用一次性纸巾擦干乳头和基部，挤奶时丢弃前两把奶，然后从第三把奶中收集50 mL接入灭菌管中。

1.2.2 显微镜计数

（1）涂布

充分摇匀新鲜采集的乳样，用微量加样器吸取灭菌管中部乳汁10 μL，将乳样滴于玻片一端中部，仔细涂布成约1 cm2面积的乳膜。

（2）干燥、脱脂、固定

涂好乳膜的玻片于37 ℃温箱中干燥后，用二甲苯脱脂5 min，再置于95%乙醇中固定5～10 min。

（3）染色

玻片干燥后，用美蓝染色液染

色5 min。水洗，再用95%乙醇脱色数分钟，水洗干燥后镜检。

（4）镜检及计数

在生物显微镜10 倍目镜油镜下观察，计数视野内100 个1 cm2面积的体细胞数，然后用下式计算：SCC=系数×每个视野的细胞平均数（细胞总数÷100），即为每毫升乳样中的体细胞数。

1.2.3 奶牛乳房炎早期诊断试剂盒检测乳样颜色变化

以移液枪吸取待检奶牛乳汁样品50 μL，加入100 μL KI裂解液，静置2 min后加入甲基绿染色液，3 min后记录颜色变化。

1.2.4 判定标准的制定

将显微镜计数结果与奶牛乳房炎早期诊断试剂盒颜色变化结果进行比对。将同一乳样的体细胞数显微镜计数结果记入表1，另将应用奶牛乳房炎早期诊断试剂盒检测的乳样颜色变化结果也填入表1，摸索体细胞数量变化与颜色变化的对应关系，从而制定判定标准。

2 结果与分析

2.1 显微镜计数与奶牛乳房炎早期诊断试剂盒颜色变化比对结果

显微镜计数结果与奶牛乳房炎早期诊断试剂盒颜色变化比对结果见表1。试验结果表明，体细胞数量变化区间对应着DNA染色的颜色变化梯度，体细胞数越多，绿色越深。由表1可知，乳样中体细胞数低于2.9×105个/mL时，对应显色颜色为浅蓝绿色；体细胞数在3.0×105～4.9×105个/mL范围内时，对应显色颜色为浅绿色；体细胞数在5.0×105～7.9×105个/mL范围内时，对应显色颜色为淡绿色；体细胞数在8.0×105～14.9×105个/mL范围内时，对应显色颜色为绿色；体细胞数在15.0×105～49.9×105个/mL范围内，对应显色颜色为深绿色；体细胞数多于50.0×105个/mL时，对应显色颜色为墨绿色。

2.2 判定标准的制定

“-”，为阴性，浅蓝绿色（体细胞数为0～2.9×105个/ mL）；“±”，为疑似，浅绿色（体细胞数为3.0×105～4.9×105个/mL）；“+”，为弱阳性，淡绿色（体细胞数为5.0×105～7.9×105个/mL）；“++”，为阳性，绿色（体细胞数为8.0×105～14.9×105个/mL）；“+++”，为强阳性，深绿色（体细胞数为15.0×105～49.9×105个/mL）；“++++”，为极强阳性，墨绿色（体细胞数多于50×105个/mL）。

表1 显微镜计数与试剂盒染色结果表

表2 判定标准

3 讨论

3.1奶牛乳房炎早期诊断试剂盒判断标准，是以目前检测奶牛是否患有乳房炎最为准确的显微镜直接计数法为设定标准依据，对同一样品同时用显微镜计数法和早期诊断试剂盒进行检测，比较体细胞数目多少和试剂盒染色深浅变化关系，确定早期诊断试剂盒的反应范围，从而制定出早期诊断试剂盒的判定标准。

3.2本试验中，诊断试剂盒的颜色变化随着体细胞数量的变化而变化，而且呈正相关，随着乳汁中体细胞数量的增多，诊断试剂盒的颜色越变越深，符合规律性变化。

3.3本试验制定的奶牛乳房炎早期诊断试剂盒判断标准是按照国际上通用的乳汁中体细胞数变化范围对应试剂盒的颜色变化程度而确定，其判断标准符合奶牛乳房炎的发生程度，与我国及国际对奶牛乳房炎的判断一致，符合奶牛乳房炎的诊断标准。

4 结论

本文制订的快速诊断试剂盒诊断标准，是以目前检测奶牛是否患有乳房炎最为准确的显微镜细胞计数法为设定标准依据，以染色颜色深浅与体细胞中DNA含量多少成正比、DNA含量多少与体细胞数量成正比的数量关系做对比，制定的奶牛乳房炎早期诊断试剂盒判定标准。判定标准准确、划分区间细致，能够以明确的颜色变化准确快速判别奶牛乳房炎发生的程度。

该试剂盒判定结果准确反映体细胞数量变化区间，能够快速判定出奶牛乳房炎发生的程度。其标准规范、操作简便，判定迅速准确，便于携带和现场应用，为判定乳汁中体细胞数目、DNA数量及食品安全行业提供了一种经济、便捷、有效、现场、适时、及时的检测手段。适用于养殖场自主大规模批量检测筛查，也适用于平时对疑似隐性乳房炎奶牛随时判定。比对目前判断奶牛乳房炎结果最为准确的体细胞计数法，该试剂盒显色正确指示了体细胞数量变化关系，进而对应判断出奶牛的健康情况。同时它还规避了体细胞计数法（SCC）、PCR检测法和乳汁电导率检测法需要在实验室中检测的局限性，也规避了乳汁pH值检测法和乳汁电导率检测法的不准确性。C

[1] 肖定汉. 奶牛病学[M]. 北京：中国农业大学出版社，2002.

[2] 李宏胜，郁杰，罗金印. 我国部分地区个体奶牛场乳房炎细菌学调查[J]. 中兽医医药杂志，2002，21（6）：14-17.

[3] 王建军，税丽. 奶牛乳房炎致病机理研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2009，36(12)：100-103.

[4] 高玉梅，郑威，杨宪苳，等. 奶水牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 广西畜牧兽医，2010，26（3）：171-173.

[5] 李成应. 治疗奶牛乳房炎的复方中药制剂的发研究：[博士论文][D]. 呼和浩特市：内蒙古农业大学，2008.

[6] 陈国灿，王九峰，金嘉，等. 奶牛隐性乳房炎诊断新方法探讨[J]. 中国兽医杂志，2005，41（9）：31-32.

[7] 冯万宇，周庆民，徐馨，等. 奶牛体细胞裂解方法的研究进展[J]. 养殖与饲料，2016（10）：6-7.

[8] 杨宇，吕英，石晶，等. 奶牛乳房炎乳中结合珠蛋白含量的夹心ELISA检测方法研究[J].中国预防兽医学报，2011，31（6）：452-456.

黑龙江省省属科研院所专项资金项目“奶牛乳房炎早期诊断盒及无抗治疗剂的研究”]

周庆民（1964-），男，本科，研究员，研究方向为临床诊疗与新兽药开发。

2017-05-20）

⋆通信作者：徐馨（1983-），女，汉，硕士，助理研究员，主要从事新药开发与疾病诊疗。