杞精明目汤药物血浆对结膜松弛症成纤维细胞TSG-6和PTX3表达的影响

柯梅青，张兴儒，项敏泓，李青松，王晗敏，周桂贞

·论著：实验研究·

杞精明目汤药物血浆对结膜松弛症成纤维细胞TSG-6和PTX3表达的影响

柯梅青，张兴儒，项敏泓，李青松，王晗敏，周桂贞

目的研究杞精明目汤药物血浆对结膜松弛症成纤维细胞肿瘤坏死因子α刺激基因6（TSG-6）和穿透素3（PTX3）表达的影响，探讨结膜松弛症的发病机制及杞精明目汤对其影响作用。方法制备杞精明目汤药物血浆和无药血浆，分别用含20%、10%、5%药物血浆或无药血浆的细胞全培养基培养结膜松弛症成纤维细胞，4 h、24 h后分别提取mRNA和蛋白质，采用实时荧光定量PCR（real time PCR）技术和Western blot法检测细胞TSG-6、PTX3以及基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3的表达。结果20%和10%的含药血浆均可有效上调结膜松弛症成纤维细胞TSG-6mRNA和蛋白的表达，且作用接近（P＞0.05），而5%浓度的含药血浆对TSG-6mRNA和蛋白的表达无明显上调作用。三种浓度的含药血浆对结膜松弛症成纤维细胞PTX3mRNA和蛋白的表达无明显作用。三种浓度的含药血浆均可明显抑制结膜松弛症成纤维细胞MMP-1mRNA和蛋白的表达，其中20%和10%浓度对MMP-1mRNA抑制作用较强，效果接近（P＞0.05），其次为5%；20%浓度含药血浆对MMP-1蛋白表达的抑制作用最明显，10%和5%浓度对MMP-1蛋白表达的抑制作用无明显差异（P＞0.05）。三种浓度的含药血浆均可有效抑制MMP-3mRNA和蛋白的表达，其中对MMP-3mRNA及蛋白的抑制作用最显著的均为20%浓度的含药血浆，其次为10%。结论20%和10%浓度的杞精明目汤药物血浆能有效上调TSG-6的表达；20%、10%、5%三种浓度的含药血浆对PTX3的表达均无明显作用；三种浓度的杞精明目汤药物血浆均能有效抑制MMP-1、MMP-3的表达。

结膜松弛症；杞精明目汤；肿瘤坏死因子α刺激基因6；穿透素3

结膜松弛症（conjunctivochalasis,CCh）是过度松弛的球结膜堆积在睑缘、内、外眦部之间形成皱褶，引起眼表泪液学异常，并伴有眼部干涩、异物感、泪溢等不适症状的一种眼病[1-2]。目前认为CCh是一种常见的年龄相关性老年性疾病，但该病病因及发病机制仍不明了。

临床研究发现CCh的松弛结膜组织变薄，结膜基质及结膜下Tenon’s囊菲薄甚至溶解消失；相关基础研究证实CCh结膜基质及Tenon’s囊的溶解、变薄可能与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP），尤其是MMP-1、MMP-3在结膜组织和泪液中的表达量增多、酶活性增强引起MMPs和金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor ofmetalloproteinase,TIMP）比例失衡有关[3-9]。国内外多项研究证实，抗炎蛋白肿瘤坏死因子-α刺激基因6（tumor necrosis factor alpha stimulated gene-6,TSG-6）和穿透素3（pentraxin3,PTX3）（又称为TNF-α刺激基因14），在松弛结膜组织及体外培养的结膜成纤维细胞中均有较高表达[10-13]；TSG-6siRNA或PTX3siRNA下调结膜松弛症成纤维细胞TSG-6或PTX3基因的表达后，均可使MMP-1、MMP-3的表达明显增加，并且结膜成纤维细胞凋亡明显增加；TSG-6和PTX3或通过抑制结膜成纤维细胞MMP-1、MMP-3的转录和活化及细胞凋亡限制结膜松弛症的发病进程[12-13]。

本课题组既往研究发现，杞精明目汤药物血浆可明显抑制体外培养的松弛结膜成纤维细胞分泌MMPs并有效提高TIMPs的表达[14]，促进MMPs/ TIMPs平衡的恢复，延缓结膜松弛症发病进程；故本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction,real time PCR）联合Western blot法进一步检测杞精明目汤药物血浆对松弛结膜成纤维细胞胞内MMP-1、MMP-3的影响，并首次研究杞精明目汤药物血浆对两种抗炎蛋白TSG-6、PTX3的调控作用，为探讨CCh的临床治疗方案提供有价值的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

雄性SD大鼠24只，普通级（CV），体质量（200± 20）g（上海中医药大学附属普陀医院中心实验室动物房提供）。杞精明目汤[15]成分：黄精20 g、麦冬20 g、旱莲草15 g、枸杞子15 g、茯苓10 g、川芎3 g、炙甘草3 g。根据“人和动物之间按体表面积折算的等效计量比值”计算出与70 kg成人用药量相当的200 g大鼠的等效计量，将药液浓缩为含生药3.35 g/ml，于4℃冰箱保存备用。DMEM培养基、青-链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶溶液（含0.02%EDTA）（美国Gibco公司）；胎牛血浆、成纤维细胞生长添加物（FGS）（美国ScienCell公司）；Trizol（日本Takara公司）；cDNA第一条链合成试剂盒、荧光定量聚合酶链反应试剂盒（瑞士罗氏公司）；引物、荧光探针（MMP-1、MMP-3、TSG-6、PTX3、GAPDH）（上海生工公司）；MMP-1单克隆抗体、MMP-3单克隆抗体（英国Abcam公司）；TSG-6单克隆抗体、PTX3单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、BeyoECLPlus（上海碧云天公司）；BSA（美国Sigma公司）；CO2培养箱（日本SANYO公司）；超净工作台（中国安泰公司）；低温高速离心机、分光光度计、梯度PCR仪（德国Eppendorf公司）；荧光定量PCR仪ABI7300（美国ABI公司）；酶标检测仪、垂直电泳槽、转膜仪（美国BIO-RAD公司）；化学发光分析系统仪（中国培清公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 组织标本采集实验所用结膜组织来自2015年1月—2015年6月在上海中医药大学附属普陀医院眼科行新月形松弛结膜切除术的患者，共6例6只眼，纳入患者符合文献[1]的诊断标准，并属于结膜松弛症手术适应症。本研究遵循赫尔辛基宣言，获得上海中医药大学附属普陀医院伦理委员会批准，对所有样本提供者进行知情同意并签署知情同意书。

1.2.2 结膜松弛症球结膜成纤维细胞培养参照韩竹梅[16]结膜成纤维细胞培养方法：将切取的球结膜组织用0.9%的生理盐水漂洗3遍，用眼科显微剪刀将组织剪成0.5～1mm2大小，平铺于6孔板内，将6孔板翻转为底朝上，然后置于37℃、体积分数5% CO2培养箱中，待组织块周边接近干燥（约1～3min）时将6孔板翻转，于超净台中缓慢加入3ml含体积分数10%胎牛血浆、1%双抗和1%FGS的DMEM培养液，勿使组织浮起，继续培养，每3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及培养情况，并对培养的细胞按照成纤维细胞鉴定方法鉴定[16]。

1.2.3 制备药物血浆将24只SD大鼠编号，按随机数字表分为杞精明目汤组和生理盐水对照组，每组12只。杞精明目汤组给予杞精明目汤灌胃，每次2ml/只，每日2次，连续5 d；生理盐水对照组给予生理盐水灌胃，每次2m l/只，每日2次，连续5 d。于最后一次灌胃2 h后（灌胃前12 h禁食不禁水），2.5%戊巴比妥钠，1.5m l/kg腹腔麻醉后，消毒，无菌操作下打开腹腔，腹腔动脉采血，静置2 h，2000 r/min离心25min，无菌操作下分离出血浆，56℃水浴灭活30min，0.22μm过滤器过滤后-20℃下保存备用。临用前用含1%青-链霉素的DMEM培养液配制成5%、10%、20%的含药或无药血浆。

1.2.4 杞精明目汤药物血浆刺激实验选择3～6代80%融合的对数生长期CCh成纤维细胞，将细胞培养基换为无血浆培养基继续培养24 h后，弃去培养基，分别加入无药或含药血浆终浓度分别为5%、 10%、20%的细胞全培养基，同时设PBS阴性对照组，继续培养至4 h分别提取各组的RNA用于real time PCR检测，剩余细胞继续培养至24 h提取各组的蛋白质，用于Western blot实验。

1.2.5 real time PCR测结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3mRNA的表达采用Trizol法提取贴壁成纤维细胞mRNA，进行real time PCR检测。以oligd（T）18为引物，mRNA模板1μg，合成cDNA第一链；荧光定量PCR按20μl反应体系进行：10×PCR缓冲液10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，荧光探针1μl，cDNA1μl，PCR级ddH2O 6μl。样品和内参均设3个复孔，同时设无mRNA（空白）对照组和基因组（无逆转录酶），引物探针序列见表1。反应条件为：95℃1min，95℃30 s，60℃30 s，共40个循环，ABI7300全自动荧光定量PCR仪进行反应；反应结束后，电脑自动分析荧光信号并将其转换为CT值；目的基因相对表达水平的计算采用样品各自内源控制物GAPDH的表达量来标准化加入的初始RNA量，即每个样品靶基因的相对表达水平△CT值=靶基因CT值-GAPDH的CT值；通过比较不同组的△△CT值=△CT1-△CT2，计算2-△△CT值，间接反映各组模板的起始拷贝数之间的倍数关系（real time PCR实验过程中所用到的耗材均用DEPC水灭活RNA酶）。

表1 目的基因引物序列及产物长度目的基因

1.2.6 Western Blot法检测结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白的表达RIPA裂解细胞提取蛋白质，BCA法检测蛋白浓度，并调整各组蛋白浓度至同一水平，蛋白变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白：蛋白上样量取50μg，上层胶5%，下层胶10%，上层胶电压80 V，下层胶电压100 V，垂直电泳1.5 h，半干式转膜1 h，电压15 V，将凝胶上的蛋白转至PVDF膜上，5%BSA室温封闭2 h，4℃孵育一抗过夜，HRP标记的山羊抗鼠IgG/HRP标记的山羊抗兔IgG二抗分别室温孵育对应的一抗1 h，ECL化学发光法曝光，化学发光分析系统仪拍照。以GAPDH为内参，采用Image J分析软件对条带进行半定量分析，以TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白灰度值进行计算。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析。本研究检测指标的数据资料经W检验接近正态分布，以x軃±s进行统计描述，组间均数经Levene检验方差齐，各组目的基因、目的蛋白的差异总体比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表2 各组CCh结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3mRNA的相对表达量（軃±s）

表2 各组CCh结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3mRNA的相对表达量（軃±s）

注：组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。与对照组比较，①P<0.05；与20%含药血浆比较，②P<0.05；与10%含药血浆比较，③P<0.05 CCh：结膜松弛症TSG-6：肿瘤坏死因子α刺激基因6 PTX3：穿透素3 MMP-1：基质金属蛋白酶1 MMP-3：基质金属蛋白酶3 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

组别样本量TSG-6/GAPDH PTX3/GAPDH MMP-1/GAPDH MMP-3/GAPDH对照组20%含药血浆组10%含药血浆组5%含药血浆组20%无药血浆组10%无药血浆组5%无药血浆组1.03±0.07 0.47±0.11①0.70±0.17①②0.75±0.12①②③0.97±0.14 0.93±0.12 0.89±0.22 F值P值6 6 6 6 6 6 6 1.07±0.11 1.70±0.20①1.53±0.24①0.97±0.14 1.02±0.10 0.99±0.13 1.03±0.11 1.02±0.12 1.17±0.17 1.07±0.25 0.90±0.25 1.10±0.13 1.00±0.20 0.91±0.14 1.03±0.07 0.40±0.04①0.50±0.06①0.80±0.12①②③1.12±0.14 0.98±0.09 1.01±0.15 22.176＜0.001 1.669 0.158 43.879＜0.001 5.820＜0.001

图1 Western Blot法检测各组CCh结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白表达的电泳图TSG-6：肿瘤坏死因子α刺激基因6 PTX3：穿透素3 MMP-1：基质金属蛋白酶1 MMP-3：基质金属蛋白酶3 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

2 结果

2.1 杞精明目汤含药血浆对CCh成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3 mRNA表达的影响

20%和10%的含药血浆均可有效上调CCh成纤维细胞TSG-6mRNA的表达，且作用接近（P＞0.05），而5%浓度的含药血浆对TSG-6 mRNA的表达无明显上调作用；三种浓度的杞精明目汤含药血浆对CCh成纤维细胞PTX3 mRNA的表达无明显影响；三种浓度的杞精明目汤含药血浆均可明显抑制体外培养的CCh成纤维细胞MMP-1 mRNA的表达，其中20%和10%浓度抑制作用较强，数值结果亦无明显差异（P＞0.05）；20%、10%、5%浓度的药物血浆均可有效抑制MMP-3mRNA的表达，其中20%的抑制作用最显著，其次为10%（表2）。

2.2 杞精明目汤含药血浆对CCh成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白表达的影响

不同浓度含药血浆对CCh成纤维细胞各蛋白指标表达的影响与前述对mRNA的影响大致相同。20%和10%的含药血浆可有效上调CCh成纤维细胞TSG-6蛋白的表达。三种浓度的含药血浆均可明显抑制MMP-1蛋白、MMP-3蛋白的表达，对MMP-1蛋白，20%浓度抑制作用最明显，10%与5%浓度的抑制作用无明显差别；对MMP-3蛋白，20%作用最显著，其次为10%。杞精明目汤含药血浆对PTX3蛋白的表达无明显影响（图1，表3）。

表3 各组CCh结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白的相对表达量（軃±s）

表3 各组CCh结膜成纤维细胞TSG-6、PTX3和MMP-1、MMP-3蛋白的相对表达量（軃±s）

注：组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。与对照组比较，①P<0.05；与20%含药血浆比较，②P<0.05；与10%含药血浆比较，③P<0.05 CCh：结膜松弛症TSG-6：肿瘤坏死因子α刺激基因6 PTX3：穿透素3 MMP-1：基质金属蛋白酶1 MMP-3：基质金属蛋白酶3 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

组别样本量TSG-6/GAPDH PTX3/GAPDH MMP-1/GAPDH MMP-3/GAPDH对照组20%含药血浆组10%含药血浆组5%含药血浆组20%无药血浆组10%无药血浆组5%无药血浆组0.95±0.03 0.25±0.02①0.42±0.01①②0.62±0.05①②③0.91±0.03 0.92±0.04 0.96±0.08 F值P值6 6 6 6 6 6 6 0.877±0.07 1.13±0.09①1.04±0.11①0.93±0.05 0.94±0.04 0.93±0.11 0.89±0.10 1.11±0.05 1.11±0.14 1.08±0.12 1.07±0.16 1.06±0.10 1.09±0.03 1.04±0.11 0.99±0.05 0.10±0.01①0.42±0.10①②0.45±0.02①②0.96±0.11 1.00±0.05 0.96±0.03 6.784 0.003 0.276 0.945 191.236＜0.001 270.868＜0.001

3 讨论

西医对CCh的治疗主要采取局部人工泪液滴眼和手术切除。人工泪液只能暂时缓解症状，且易反复；手术切除病变组织创伤大，患者不易接受。本研究着眼于中医，在既往研究的基础上，为杞精明目汤治疗CCh提供理论依据。CCh可归属于中医“白涩症”范畴，临床主要表现为眼内干涩不爽，双目频眨，羞明畏光，白睛隐隐淡红，久视后则诸症加重，伴口燥咽干，头晕目眩，腰膝酸软，五心烦热，夜寐不安，潮热盗汗，舌红少苔，脉沉细。病机多为肝肾阴虚，拟方精杞明目汤补肾养阴生津治疗。方中枸杞子滋补肝肾，益精明目，黄精健脾益肾，补气养阴，麦冬养阴生津，共同为君药，滋补肝肾，养阴生津；脾胃为后天之本，茯苓、炙甘草健脾益气，以助气血生化之源；阴虚生热，旱莲草滋补肝肾，凉血止血，与茯苓共为臣药；川芎活血行气，祛风止痛，引药以上行头目。全方共奏滋补肝肾，培补先天之精血，健脾益气，以助气血生化之源[15]。

本研究结果表明不同浓度的杞精明目汤药物血浆对TSG-6和MMP-1、MMP-3基因的转录和蛋白的表达均有调控作用。其中20%和10%浓度的含药血浆具有上调CCh成纤维细胞表达TSG-6的作用，而5%的含药血浆对其影响作用不明显；20%和10%的含药血浆对MMP-1mRNA转录的抑制作用最显著，其次是5%的含药血浆；20%的含药血浆对MMP-1蛋白表达的抑制作用最显著，而10%和5%浓度对MMP-1蛋白表达的抑制作用差异无统计学意义；三种浓度的含药血浆对MMP-3均有抑制作用，最显著的是20%含药血浆，其次为10%；三种浓度的含药血浆对CCh成纤维细胞PTX3的表达均无明显调控作用。与前期基础研究证实杞精明目汤药物血浆可以有效抑制MMPs表达，同时能上调TIMPs的表达，促进MMPs和TIMPs之间平衡恢复[14]的结果一致。

松弛结膜堆积在睑缘内外眦部之间，不仅引起眼表泪液动力学异常，还可导致泪液中炎症相关蛋白[白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、TNF-α、IL-6和α1酸性糖蛋白（α1-acid glycoprotein, A1AG）、钙结合蛋白S100-A4、S100-A8等][17-18]凋亡，凋亡调节相关蛋白[19]以及降解酶（MMP-9）[8]等表达亦明显增加。研究表明炎性细胞因子（TNF-α或IL-1β）可明显上调结膜松弛症成纤维细胞MMPs及TSG-6、PTX3的表达[11-13]，同时siRNA干扰下调结膜松弛症成纤维细胞TSG-6或PTX3基因的表达后，MMP-1、MMP-3的表达及细胞凋亡均明显增多[12-13]。本研究结果显示杞精明目汤药物血浆能够上调CCh成纤维细胞表达TSG-6，同时抑制MMPs的表达，提示杞精明目汤药物血浆或能局限炎症反应作用，恢复局部炎性反应蛋白及抗炎蛋白之间的平衡作用；而杞精明目汤药物血浆对PTX3的表达影响不明显，推测原因为TSG-6和PTX3在CCh发病机制中所发挥的作用不一致，PTX3的作用可能不在于炎症保护方面，或与CCh细胞凋亡有关；这些推论还需进一步研究证实。

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Effects of Qijing M ingmu decoction on expression of TSG-6 and PTX3 in conjunctivochalasis

KE Meiqing,ZHANG Xingru,XIANG Minhong,et al.
Putuo Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai200062,China

OBJECTIVE To investigate the effects ofQijing Mingmu decoction on expression of TSG-6 and PTX3 in conjunctival fibroblastsof conjunctivochalasis(CCh).METHODS Differentconcentration(5%,10%,20%) ofdrug serum or drug free serum were prepared.Conjunctival fibroblastsofCCh were cultured with different concentration of drug serum or drug free serum for 4 or 24 hours before being harvested for total RNAs or proteins,respectively.The expressing levelsofmRNA and proteinsof TSG-6,PTX3,MMP-1 and MMP-3were detected by quantitative real time PCR(real time PCR)and western blot assay.RESULTS The 20%and 10%concentrations of drug serum containing Qijing Mingmu decoction effectively increased the expression of TSG-6 mRNA and protein,and their effectswere statistically similar(P>0.05);while the concentration of5%medicated serum had no significanteffecton theexpression of TSG-6mRNA and protein.The concentration of20%,10%and 5%medicated serum had no significanteffecton the expression of PTX3mRNA and protein.Three concentrations of drug serum all significantly reduced the expression ofMMP-1mRNA and protein.The inhibition effects of 20%and 10%medicated serum on MMP-1 mRNA were obvious,but of no significant difference (P<0.05),and both greater than it of 5%;Themost dramatic inhibition effect ofmedicated serum on MMP-1 protein was from 20%medicated serum,and there was no significant difference between effects of 10%and 5%concentration(P> 0.05).All three different concentrations of drug serum signifi-cantly reduced the expression of MMP-3 mRNA and protein.Themost obvious inhibitory effect of drug serum on MMP-3mRNA and protein was from 20%,the second effective concentration was 10%.CONCLUSIONS The 20% and 10%drug serum containing QijingMingmu decoction could up-regulate the expression of TSG-6 in fibroblasts of conjunctivochalasis.The three concentrations of drug serum containing Qijing Mingmu decoction had no significant effecton PTX3 but they could effectively inhibit theexpression ofMMP-1 and MMP-3.

conjunctivochalasis;Qijing Mingmu decoction;tumor necrosis factor alpha stimulated gene 6; pentraxin3

R777.3

A

1002-4379（2017）02-0087-06

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.02.005

上海市普陀区高层次人才科研创新资助项目（2014-A-22）；上海市医学重点专科（ZK2015A20）

上海中医药大学附属普陀医院眼科，上海200062

张兴儒，E-mail：zhangxingru928@163.com