Autotaxin蛋白修饰性位点的生物信息学预测*

曹 睿 赵 邑 潘薇薇 曹鹏程 梁雅丽 谢海军

（山西省生物研究所 山西太原 030000）

0 引言

Autotaxin（ATX）蛋白1992年首次在人的黑色素瘤细胞系A2058中发现［1］，是一种自分泌活性因子，是分子量为126-kDa的糖蛋白。能够以溶血磷脂酰胆碱（1ysophosphatidyIcholine，LPC）为底物催化生成溶血磷脂酸（1ysophosphatidic acid，LPA），表现出磷酸二酯酶活性，被归为磷酸二酯酶家族（ENPP2 家族）［2］。除了磷酸二酯酶活性外，Autotaxin蛋白还同时具有焦磷酸酶和 ATP酶活性［3］。Autotaxin在肿瘤细胞中对肿瘤的发生和发展，特别是肿瘤的迁移起着重要作用，其抑制剂的开发并被认为可能为治疗肿瘤提供方法［4］。在Autotaxin蛋白的催化结构域中一些氨基酸的糖基化至关重要，已有研究表明Asn524的糖基化对于Autotaxin蛋白发挥活性是必需的。例如：在脂肪细胞中，Asn53和Asn410的N端糖基化对于Autotaxin的分泌和活性很重要［4-5］。因此研究Autotaxin蛋白的磷酸化、糖基化等催化位点非常重要，可以采取生物信息学手段完成预测工作，为进一步挖掘其生物学意义提供理论基础和研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人Autotaxin蛋白fasta格式数据来自NCBI蛋白数据库，全长 915 aa，GenBank号为：AAA64785.1。

1.2 方法 Autotaxin蛋白的磷酸化位点分析分别利用软件 DISPHOS 1.3［6］、PhosphoSitePlus［7］、KinasePhos［8］、Scansite［9］、NetPhosk［10］、Musite［11］进 行预测，这些软件是现今比较常用的磷酸化位点预测软件。

Autotaxin（ATX）蛋白的糖基化位点（N-型、O-型）分别用 NetNGlyc1.0［12］、Uniprot数据库、NetOGlyc4.0［13］、YinOYang［14］1.2 软件进行预测。 各数据库软件参数如无特别说明均取默认值（表1）。

表1 预测工具软件简介

2 结果与分析

2.1 磷酸化位点分析结果 6款软件预测的所有磷酸化位点中，有4款软件同时预测到的位点有 2个，分别是：S-330，T-328；有 3款软件同时预测到的位点有3个，分别是：S-860，S-861，T-333；有2款软件同时预测到的位点有12个，分别是：S-58，S-302，S-308，S-326，S-327，S-729，S-741，S-865，T-210，T-288，T-83，T-368（表 2）。

6款预测软件中，DISPHOS 1.3预测的全部结果均与其他软件预测结果重合，其次，预测重复率较 高 的 软 件 有 ：Scansite、Musite、PhosphoSitePlus。预测结果最多的为NetPhosk，KinasePhos预测结果中重复预测率较低。NetPhosk是这6款软件中预测位点最多的，共有Ser修饰位点26个，Thr修饰位点13个，Tyr修饰位点10个。Musite软件预测的位点最少，Ser修饰位点 3个，Thr修饰位点 1个，Tyr修饰位点1个。

表2 Autotaxin蛋白磷酸化位点预测

通过对预测结果分析可知，丝氨酸（Ser）修饰位点较多，被重复预测到的有11个位点；其次是苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr），被重复预测到的位点均为3个。此外，Scansite还预测到脯氨酸（Pro354、Pro735）及亮氨酸（Leu498）修饰位点。

2.2 糖基化位点分析结果 N型糖基化位点的预测通过Uniprot数据库查询及NetNGlyc1.0软件预测，重复被预测到的位点为N-54。

O型糖基化位点的预测通过NetOGlyc4.0、YinOYang1.2软件进行，重复被预测到的位点为O-695、O-696、O-712。

3 讨论

蛋白质翻译后修饰对细胞的调控机制起重要作用，它能影响蛋白的多种属性，包括蛋白质折叠、活性及最终功能［15］。蛋白质的磷酸化和糖基化的过程为：蛋白质在蛋白激酶催化下将磷酸集团由ATP转移到目标蛋白质上，将低聚糖转移到蛋白质骨架上，主要的生物学功能有：信号转导、酶活性调节、新陈代谢、蛋白质稳定性与溶解度，抗原性、蛋白质靶标、细胞-细胞相互作用等［16］。真核生物磷酸化位点一般有丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。其中，丝氨酸和苏氨酸是最常见的磷酸化位点［17］，因为其结构末端含有羟基，羟基很活泼，可以与磷酸基团结合。所以说，蛋白质中如果某个丝氨酸很保守的话，很大程度上就是磷酸化位点。

本研究利用生物信息学软件对Autotaxin蛋白进行磷酸化和糖基化位点预测。大部分生物信息学软件的设计思路是基于已有数据的汇集，结合数学模型的设计和计算机技术的集成开发而成。已有实验或文献数据的提供可使预测结果具有可靠性高、可重复性强、可验证性高的优势，缺点是较少提供新的数据集，科学合理的数学模型和训练集可弥补此缺陷。

本研究磷酸化位点预测中使用到的软件，大部分利用的是隐马尔科夫模型（DISPHOS 1.3、KinasePhos）［18-19］，NetPhosk 则采用人工神经网络算法［20］，Musite采用机器学习方法。从软件本身预测结果及被其他软件重复预测到的比例看，预测准确 率 排 序 为 ：DISPHOS 1.3、Scansite、Musite、Net-Phosk、PhosphoSitePlus、KinasePhos。 从重复被预测到的结果看，12个位点中有 5个位点（Y-83、T-210、T-288、S-302、S-308）是文献中有明确报道为磷酸化位点的。不同的数学模型、算法对于预测结果的影响是较为显著的。因此，在初步筛选数据集阶段，应该尝试多软件、换参数等方式，达到数据集尽可能精确、可验证的目的。为实验验证提供重要的依据和基础。

4 结论

识别蛋白质修饰的传统方法中质谱、磷酸盐标记等实验手段能检测的修饰活性位点十分有限，费时费财，产出较慢。本项目采用高效、可靠的生物信息学手段，对Autotaxin蛋白质修饰活性位点预测，为其抑制剂的开发提供潜在靶点。