课堂教学中疟原虫血涂片染色方法的改进*

温砚子 张 平 黄建荣

（中山大学生命科学学院 广东广州 510275）

传统上疟原虫的血涂片染色主要采用的是Giemsa染色法［1］。但Giemsa染色效果易受到染色液质量（包括染色液制备时间、染色液的来源、是否进行充分过滤等）、染色时间、冲洗时间等因素的影响［2-3］，稳定性较差。在教学过程中，学生的操作参差不齐，呈现的染色效果差异很大，直接影响后续的观察，影响到教学质量的稳定。Diff-Quik染色法是世界卫生组织（WHO）推荐的一种快速染色方法［4］。主要是由以美蓝和伊红为基础的Wright染色法改良而来，和Wright染色方法相比进一步缩短了染色时间。而传统Giemsa染色液采用天青B和曙红Y为基础，2种染料在水溶液中易氧化形成沉淀。和Giemsa染色法相比，Diff-Quik染色时间更短，染液稳定无沉渣、染色背景清晰。基于这些优点，Diff-Quik染色法在国内外已经被广泛应用于临床检测及动物实验中，包括精子染色、血液染色、体液（体腔液和尿液）染色、穿刺细胞学标本染色、甲状腺穿刺细胞学染色及非肿瘤病变的细胞结构观察等［5-6］。本研究将比较Giemsa和Diff-Quik 2种染色方法对疟原虫血涂片染色后的效果。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1）由中山医学院实验动物中心提供的感染伯氏疟原虫（Plasmodium Berghei）的 BALB/C小鼠 2只（感染率约10%~20%）。

2）试剂：Giemsa 染液（Sigma，USA），Diff-Quik A/B 染液（Baso，中国），甲醇，清水，pH6.6 磷酸缓冲液。

3）器材：小鼠取血夹，剪刀，玻片，染色板，滴管，烧杯。

1.2 实验方法

1）取感染疟原虫的BALB/C小鼠，剪尾末端，取适量的血于玻片上，制作血涂片，并将玻片进行标记。

2）甲醇固定，干燥后进行染色。

3）染色（采用2种不同染色方法）。

虽然微信公众平台是获取信息最直接的渠道，但是随着微信公众平台的功能日渐成熟，现在的公众号已经不仅仅是浏览信息的平台了，那么为了进一步提高转化率，刺激用户下一步的行为，运营团队可以在视频教学部分丰富教学方式，比如开通微信网课学习平台，用最好的资源来让全国各地的爱好者感受名师的一对一教学和实地教学。这不仅让用户能身临其境地进行线上学习，还能极大地提高用户黏性。

①Giemsa染色法：将玻片血膜朝下放置于染色板上，滴加1×Giemsa染液与涂片上血膜接触，染色30~40 min。

②Diff-Quik染色法：将Diff-Quik A染液滴加至玻片上，覆盖血膜，染色30 s；用pH6.6的磷酸缓冲液冲洗多余的染液，稍甩干；将Diff-Quik B染液滴加至玻片上，覆盖涂片上的血膜，染色30 s。

4）洗片。将染色后的玻片放入盛满清水的烧杯中，随后取出，待玻片自然干燥后在油镜下进行观察。

2 实验结果及讨论

1）经Giemsa染色的小鼠疟原虫血涂片，背景颜色较淡，红细胞着色不深（图1），在课堂教学中由于学生处理不当（例如过度洗脱染液），甚至出现红细胞完全不着色的情况。这样的染色效果让学生无法准确统计小鼠疟原虫的感染率。同时，经Giemsa染色后的疟原虫细胞核、细胞质颜色分辨不明显，特别是细胞质相对较小的环状体，经Giemsa染色后不能明显展现它的典型结构（图1A），影响学生对疟原虫红内期各形态做出正确判断。

图1 伯氏疟原虫血涂片不同染色方法比较（400×）

2）Giemsa染液残渣较多，即使在对染液进行过滤处理，但在染色后的血涂片上仍不可避免地出现一些残渣，干扰初学者对血涂片中原虫的观察和分析。

3）Giemsa染色法耗时长，需要 30~40 min，Diff-Quik染色法则只需要30 s。

Diff-Quick染色已经被证实能够很好地反映细胞质细节［2，7］，Diff-Quik 染色后红细胞及疟原虫的着色明显，疟原虫的细胞核（紫红色）和细胞质（蓝色）容易区分，并且血涂片背景干净、清晰。将Diff-Quik染色法应用于疟原虫血涂片染色的教学中，能确保教学顺利进行，以达到教学目的，也为实现高质量的教学提供保障。

此外，甲醇固定干燥后应尽快进行染色，否则细胞脱水严重，影响染色效果。用Diff-Quik染液A染色后，需要用磷酸缓冲液清洗多余的染液。多次试验效果显示，需保证磷酸缓冲液的pH值为6.6，过碱溶液将会导致细胞质不着色。

Giemsa染色后的疟原虫血涂片保存时间较长，约2~3年［8］利用 Diff-Quik染色法获得的玻片是否能进行长时间保存还需进一步证实。与Giemsa染色相比，疟色素累积形成的疟色粒经Diff-Quik染液染色后呈深蓝色，不像Giemsa染色后表现出褐色，深蓝色不易与细胞质分开。