魔芋ACE抑制肽的分离纯化及活性检测

毛跟年，周亚丽，贺磊，曹晴，王勇,2，李彦军,2

1(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安，710021)2(陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安，710021)

魔芋ACE抑制肽的分离纯化及活性检测

毛跟年1*，周亚丽1，贺磊1，曹晴1，王勇1,2，李彦军1,2

1(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安，710021)2(陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安，710021)

利用碱溶酸沉法从魔芋飞粉中提取魔芋蛋白，以魔芋蛋白为原料，利用碱性蛋白酶酶解制备魔芋ACE抑制肽粗品；其粗品通过超滤法除去大分子杂质，再经过Sephadex G-15柱层析分离，最后经过RP-HPLC纯化后得到纯度较高的魔芋ACE抑制肽，并且对超滤膜进行选择、Sephadex G-15柱层析分离进行条件优化；以马尿酸含量为指标，紫外分光光度法测其活性。实验结果表明：选择规格为1 kDa超滤膜；Sephadex G-15最佳分离条件为浓度为120 mg/mL、流速为0.8 mL/min、上样量为1.0 mL；经过RP-HPLC纯化后得到魔芋ACE抑制肽抑制率可达到92.85%。空白液中Hip含量为22.50 mg,反应液中Hip含量为9.22 mg，说明魔芋ACE抑制肽抑制活性较好。

魔芋蛋白；ACE抑制肽；分离纯化；活性

ACE抑制肽(angiotensin-converting enzyme inhibition，ACEI)是指血管紧张素转化酶抑制剂。ACEI对 ACE 活性区域结合能力较强，共同特点是与 ACE 活性部位的锌离子结合的能力比AngI或缓激肽更强，而且结合上之后不易从 ACE 结合区释放，从而阻碍ACE催化AngI 水解成 AngⅡ及催化舒缓激肽水解成为失活片段2个过程，起到降血压的作用。与化学降血压药比较，具有分子质量小，免消化、直接吸收等特点，更具有优势和广阔的市场前景[1]。

目前，已经从燕麦蛋白、玉米醇溶蛋白、牦牛乳酪蛋白[2-4]等多种蛋白中提取出ACE抑制肽，并且通过多种分离纯化方法得到高纯度ACE抑制肽。目前广泛采用超滤、离子交换层析、葡聚糖凝胶层析、RP-HPLC、毛细管电泳法、大孔树脂吸附法等，王双等[5]应用大孔吸附树脂 DA201-C、HPLC、SephadexG-15凝胶对燕麦ACE抑制肽进行分离纯化，得到纯度较高ACE抑制肽；王振斌[6]通过超滤法分离芝麻蛋白ACE抑制肽，结果表明分子质量分布为 3～10 kDa 和小于3 kDa 酶解液抑制活性较好。目前，已有研究者利用魔芋飞粉为原料，通过酶解法提取和柱层析法分离纯化制备出魔芋ACE抑制肽，但是其他方面有待于研究。

本文利用前期工作中优化地制备出了魔芋ACE抑制肽粗品，研究了魔芋ACE抑制肽超滤、Sephadex G-15和RP-HPLC的分离纯化工艺，并采用紫外分光光度法对其活性进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

魔芋飞粉，购于陕西省镇安县雪樱花魔芋公司。碱性蛋白酶(酶活力≥20 万U/g)，上海源叶生物技术有限公司；Sephadex G-15凝胶，上海源叶生物技术有限公司；HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)，Sigma公司；ACE(血管紧张素转化酶)Sigma公司；Hip(马尿酸)标准品，上海源叶生物技术有限公司；NaOH、硼酸、硼砂、HCl、乙腈等，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

TG16-WS型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；YP802N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；PHS-3C型精密pH计，深圳市同奥科技有限公司；UV-5100紫外分光光度计,上海元析仪器有限公司;Waters制备型液相，上海科哲生化技术有限公司；超滤系统，美国Pellicon；自动部分收集器，上海精科实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 魔芋ACE抑制肽的制备

1.2.1.1 魔芋蛋白的提取

称取8 g魔芋飞粉，加入280 mL纯净水，搅拌均匀，用1.0 mol/L NaOH溶液调节飞粉液pH值至10，放入设定温度为50 ℃水浴锅中保温反应50 min，期间用1.0 mol/L的NaOH调节，保持飞粉液的pH不变。之后4 000 r/min离心15 min，收集上清液，用1.0 mol/LHCl液将上清液调至魔芋蛋白等电点pH 3.8，静置30 min，再在4 000 r/min下离心15 min，弃去上清液收集沉淀，用5倍的水对沉淀进行3次水洗后收集沉淀。将得到的蛋白质沉淀在-60 ℃下冷冻干燥24 h，即得魔芋蛋白质。根据公式得魔芋蛋白的平均提取率为60%。蛋白质提取率计算公式为：

蛋白质提取率/%=(提取的蛋白质含量/飞粉中总蛋白的含量)×100

(1)

1.2.1.2 魔芋ACE抑制肽的制备工艺

配制5份相同浓度魔芋蛋白质溶液，放在恒温磁力搅拌器上，分别加入一定量的碱性蛋白酶、复合蛋白酶、胶原蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶进行酶解，以ACE抑制率和水解度为指标，得出碱性蛋白酶为最佳用酶。碱性蛋白酶的酶解条件为pH 10、底物浓度3%、加酶量5 000 U/g、酶解温度46 ℃，酶解时间3 h。然后高温条件下灭酶10 min,待酶解液冷却至室温，将酶解液pH值调至魔芋蛋白等电点，在10 000 r/min下离心20 min后收集上清液，测其ACE抑制率。5种蛋白的ACE抑制率和水解度测定结果见图1。

A-菠萝蛋白酶；B-碱性蛋白酶；C-风味蛋白酶；D-复合蛋白酶；E-胶原蛋白酶图1 不同蛋白酶酶解后水解度和ACE抑制率测定结果Fig.1 Hydrolysis degree and ACE inhibition rate after enzymatic hydrolysis of different proteases

1.2.1.3 ACE抑制率的测定[7]

取75 μL、HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)与25 μL、ACE抑制剂(多肽液)充分混匀。在37 ℃水浴锅中温育5 min,加入25 μL、25 mu/mL ACE硼酸盐溶液，在37 ℃水浴锅中反应40 min。结束后加入200 μL、1.0 mol/L HCl液破坏反应环境，终止反应进程。然后于各试管中加入乙酸乙酯1.7 mL，使其混匀；吸取1.2 mL乙酸乙酯层于另一试管中，放入100 ℃烘箱中，挥发溶剂40 min。取出冷却后加入去离子水3 mL，混匀后在波长228 nm下测定其吸光度。

(2)

式中：A1,ACE抑制肽和ACE都存在溶液的吸光度值；A2,不加ACE抑制肽存在溶液的吸光度值；A3,ACE与HHL存在空白溶液的吸光度值。

1.2.2 超滤

超滤过程：将上述制备的魔芋蛋白酶解液用规格为10、5和1 kDa的超滤膜进行超滤，收集3种组分：Ⅰ(M<10 kDa)、Ⅱ(M<5 kDa)、Ⅲ(M<1 kDa)，各个组分经旋转蒸发浓缩后，用真空冷冻干燥机进行干燥，再测各个组分的ACE抑制率，选出ACE抑制率最高的组分进行下一步分离纯化。确定超滤膜：

以膜通量和 ACE 抑制率为参考指标对3种不同规格的超滤膜进行筛选，膜通量的计算公式如下

(3)

式中：V，透析液的体积，L；T，取样时间，h；A，膜面积，m2。

1.2.3 Sephadex G-15柱层析

采用Sephadex G-15对超滤所得分子质量小于1 kDa的组分进一步进行分离，为了达到最好的分离效果，本实验探讨了上样浓度、流速和上样量对分离效果的影响。

将处理好的Sephadex G-15凝胶装入1.6 cm×30 cm玻璃层析柱。洗脱剂为超纯水，用自动部分收集器收集洗脱液，每管收集5.0 mL，结合每管在220 nm[8]处的吸光值，考察不同上样浓度、流速和上样量对分离效果的影响，确定最佳分离条件。将最佳分离条件下不同峰段收集的组分测ACE抑制率，ACE抑制率最高组分浓缩后冷冻干燥，进一步进行纯化。

1.2.3.1 不同上样浓度对分离效果的影响

上样量为1.0 mL，控制流速为0.8 mL/min，设定不同上样浓度为：80、120、160 mg/mL。考察不同上样浓度对分离效果的影响，确定最适上样浓度。

1.2.3.2 不同流速对分离效果的影响

上样量为1.0 mL，控制上样浓度为120 mg/mL，设定不同流速为：0.6、0.8、1.0 mL/min。考察不同流速对分离效果的影响，确定最适流速。

1.2.3.3 不同上样量对分离效果的影响

流速为0.8 mL/min，控制上样浓度为120 mg/mL，设定不同上样量为：0.5、1.0、1.5 mL。考察不同上样量对分离效果的影响，确定最适上样量。

1.2.4 RP-HPLC

经Sephadex G-15分离后得到的ACE抑制率最高组分溶于水,配成20 mg/mL的溶液,利用RP-HPLC[9]进一步纯化,收集各洗脱峰经真空旋转蒸发浓缩、冷冻干燥后得到各分离组分,进行ACE抑制活性测定，抑制率最高组分测其体外抑制活性。

制备型高效液相Waters2489，色谱柱C18柱；检测波长：220 nm；柱温35℃；进样量5 mL；样品浓度：20 mg/mL；流速5 mL/min；洗脱条件：流动相A-乙腈，B-超纯水，0～10 min:20%A+80%B、10～15 min:40%A+60%B、15～20min:20%A+80%B。

1.2.5 魔芋ACE抑制肽体外活性检测

1.2.5.1 检测波长的确定

用pH值为8.3的硼酸缓冲液配制5 mmol/L的HHL溶液,用超纯水配制1 mmol/L的Hip,然后在190～350 nm波长处进行全波长扫描,确定Hip的检测波长。由图2可得到 Hip标准品溶液在波长228 nm 处有最大吸收峰。在228 nm 波长下测0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL Hip标准品溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。得到Hip标准品的曲线方程为：y=0.222 6x-0.001 5，相关系数为0.999 1，线性关系良好。由此可得出反应液和空白液中Hip浓度，并计算出含量，检测出魔芋ACE抑制肽的抑制活性。

图2 Hip检测波长的确定Fig.2 Hip detection wavelength determined

1.2.5.2 魔芋ACE抑制肽体外活性检测

采用紫外分光光度法检测魔芋ACE抑制肽的体外活性。

反应液：150 μL HHL溶液,加入50 μL经分离纯化后魔芋ACE抑制肽溶液,在37 ℃下温育5 min后加入50 μL ACE溶液，溶液开始反应,在37 ℃条件下反应40 min后，加入200 μL、1.0 mol/L HCl中止反应,得到反应液；空白对照液：用50 μL 硼酸盐缓冲液替换魔芋ACE抑制肽溶液制备反应液，即空白对照液。在228 nm检测反应液和空白对照液的吸光度值，并计算它们各自的含量。

2 结果与分析

2.1 魔芋ACE抑制肽的分离纯化

2.1.1 超滤

2.1.1.1 超滤膜的确定

由图3、图4可知，用截留分子质量分别为10、5、1 kDa 3种超滤膜进行分离，膜通量的大小随着截留分子质量的增大而增加，当超滤膜的截留分子质量达到 10 kDa时，此时的膜通量达到最大值 7.5 L/(m2·h)。相反，ACE抑制率的大小则随着截留分子量的增大呈现出减小的趋势，当超滤膜截留分子质量大小为 1 KDa 时，ACE 抑制率达到最大值 85.30%。ACE抑制肽的结构较接近，分子质量较小，所以选择截留分子质量的大小为1 kDa的超滤膜。通过规格为1 kDa的超滤膜超滤后，将得到组分冷冻干燥，分子质量大于1 kDa和小于1 kDa 2种组分比例分别是25.10%和74.90%。

图3 超滤膜分子质量大小对膜通量的影响Fig.3 The molecular weight of ultrafiltration membrane flux membrane

图4 超滤膜分子质量大小对 ACE 抑制率的影响Fig.4 Ultrafiltration membrane molecular size of ACE inhibition rate

2.1.2 Sephadex G-15柱层析

样品浓度对分离效果有较大影响，由图5可知，当上样浓度为80 mg/mL和120 mg/mL时可得到3个洗脱峰，当浓度达到160 mg/mL时，得到,2个洗脱峰。但是上样浓度为80 mg/mL和160 mg/mL时，出现拖尾，并且分离效果不明显。这可能是因为样品浓度过大会导致黏度增大，而使层析分辨率下降，样品浓度过小分子质量黏度减小，流动性较大，导致洗脱峰分不开。因此，上样浓度选用120 mg/mL。

A-浓度为 80mg/mL；B-浓度为120mg/mL；C-浓度为160 mg/mL图5 样品浓度对分离效果的影响Fig.5 Sample concentration effects on the separation

合适的流速是凝胶柱层析分离的重要条件。由图6可知，当洗脱流速从0.6 mL/min增加到0.8 mL/min时，分离效果明显，3个洗脱峰随流速增大而分离效果较好。当流速达到1.0mL/min时，仅有2个洗脱峰且峰形不佳。流速过大时，ACE抑制肽不能得到较好分离。因为凝胶柱层析的分离主要取决于分子扩散进入凝胶的机会，流速过快一些分子来不及分开就被洗脱出来，速度较小时被分离的组分因扩散又混合在一起，因此，选择洗脱流速为 0.8 mL/min为分离最佳流速。

A-流速为0.6mL/min；B-流速为0.8mL/min；C-流速为1.0mL/min图6 流速对分离效果的影响Fig.6 Flow rate effects on the separation

上样量一般为凝胶床的1%～4%，上样量也直接影响分离效果。由图7可知，上样量0.5 mL时，可得到两个洗脱峰，出现拖尾现象，上样量太少、实验效率低。当上样量为1.5 mL时，洗脱峰明显的仅有1个，而且峰形较宽，这是因为凝胶颗粒的吸附容量已经达到饱和。当上样量为1 mL时，出现3个洗脱峰且峰形较好。由峰形和洗脱峰2个指标考虑，最佳上样量为1 mL。

A-上样量为0.5 mL；B-上样量为1.0 mL；C-上样量为1.5 mL图7 上样量对分离效果的影响Fig.7 Sample volume effects on the separation

由图7-B可见，经过Sephadex G-15凝胶柱层析分离后，分子质量为小于1 kDa的组分被分离为1、2和3三个组分。分别收集这3个组分冷冻干燥，并进行ACE抑制率的测定，其中组分2的抑制活性较大，可达到90.20%，对该组分进一步进行纯化。

2.1.3 RP-HPLC

由图8可知，在RP-HPLC的C18柱上进一步纯化分离出2个主要肽峰，纯化得到的的2个主要肽峰1和2有较好的分离度,分别收集这2个肽峰,冷冻干燥后测定各峰ACE抑制率，其中峰2抑制率最高,其ACE抑制率为92.85%。并对组分2进行进一步的抑制活性检测。

图8 RP-HPLC纯化魔芋ACE抑制肽图谱Fig.8 RP-HPLC purifiedkonjac ACE inhibitory peptides Atlas

2.2 魔芋ACE抑制肽体外活性检测

以HHL为AngI的模拟底物，ACE可催化分解HHL生成马尿酸，加入ACE抑制肽后，与ACE活性区域作用,ACE活性受到抑制,于是阻止了ACE对HHL的催化分解作用,导致马尿酸的生成量减少。如图9，空白液中的马尿酸含量远远大于反应液中马尿酸的含量，其含量大约是反应液的3倍。说明魔芋ACE抑制肽对HHL分解产物Hip具有抑制作用，魔芋ACE抑制肽活性较好。

图9 魔芋ACE抑制肽抑制活性检测结果Fig. Konjac ACE inhibitory peptide inhibitory activity test results

3 小结

本研究将魔芋飞粉通过碱溶酸沉法提取魔芋蛋白，以魔芋蛋白为原料经过碱性蛋白酶酶解，得到魔芋ACE抑制肽粗品；通过超滤除去大分子杂质，分子质量为1 kDa的超滤膜分离效果较好；然后用Sephadex G-15凝胶柱层析进一步分离，将分子质量小于1 kDa的多肽区段分离为1、2和3三个组分，测3个组分ACE抑制率，其中组分2的抑制活性最高达到90.20%；最后经过RP-HPLC纯化，得到两个肽峰1和2，其中组分2的抑制活性最高，达到92.85%。利用紫外分光光度法测纯品的抑制活性，魔芋ACE抑制肽对HHL分解产物Hip具有较强抑制作用，说明魔芋ACE抑制肽活性较好。本研究以魔芋蛋白质为原料，经过分离纯化工艺得到纯度较高的魔芋ACE抑制肽，既拓宽了魔芋ACE抑制肽的分离纯化方法，也为魔芋飞粉的开发利用及生产高附加值产品开辟了一条新途。

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Separation and purification of konjac ACE inhibitory peptides and active substance detection

MAO Gen-nian1*,ZHOU Ya-li1, HE Lei1, CAO Qing1，WANG Yong1,2, LI Yan-jun1,2

(School of Food and Biological Engineering ,Shaanxi Unversity of Science & Technology, Xi’an 710021,China)2(Shaanxi Research Institute of Agricultural Products Processing Technology,Xi'an 710021,China)

Protein was extracted from konjac powder by alkali extraction and acid precipitation method; konjac protein is material, konjac ACE inhibitory peptides crude were prepared by alkaline hydrolysis protease on konjac protein; its crude macromolecular impurities were removed by ultrafiltration, Sephadex G-15 column chromatography, and RP-HPLC purification. Highly purified konjac ACE inhibitory peptide was obtained. The ultrafiltration, Sephadex G-15 column chromatographic separation conditions were optimized; hippuric acid was used as the index and Spectrophotometric was used to determine the activity. The results showed that an ultrafiltration membrane has a molecular weight of 1 kDa, The optimal separation condition for Sephadex G-15 was 120 mg/mL, flow rate was 0.8 mL/min, sample volume was 1.0 mL. After RP-HPLC purified, konjac ACE inhibitory peptide inhibition rate was reached to 92.85%. Blank solution Hip content was 22.50 mg, the reaction mixture Hip content was 9.22 mg, which indicates that konjac ACE inhibitory peptide inhibitory activity was better.

konjac protein; ACE inhibitory peptides; separation and purification;activity

学士，教授(本文通讯作者,E-mail：maogn@sust.edu.cn)。

陕西省科技攻关项目(2016NY-167)；西安市科技计划项目(NC1405(3))；陕西省农业科技创新与攻关项目(2015NY010、2016NY-142)；陕西省协同创新计划项目(2016XT-21)

2016-09-28，改回日期：2016-11-23

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706027