响应面法优化连翘总黄酮提取工艺研究

王润梅，张永芳，刘丽敏，刘 瑞，郭晓锋

（山西大同大学生命科学学院，山西大同037009）

响应面法优化连翘总黄酮提取工艺研究

王润梅，张永芳，刘丽敏，刘 瑞，郭晓锋

（山西大同大学生命科学学院，山西大同037009）

利用响应面分析法优化连翘总黄酮的提取工艺以得到最佳提取条件。以连翘为原料，采用超声波辅助有机溶剂乙醇提取总黄酮，对提取温度、超声功率和乙醇浓度进行单因素试验，按照Box-Benhnken的中心组合试验原理，得出响应面实验方案和结果，利用Design-Expert软件分析结果，以确定最佳提取条件。最佳提取工艺为温度57.2℃，超声功率66.2%，乙醇浓度56.2%。在此条件下，理论提取率为15.08%，验证值为14.77%。该结果对于更好地开发利用连翘总黄酮有重要的实践意义。

连翘；总黄酮；响应面法；工艺优化

连翘(Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)，系木犀科连翘属，其果可入药，是国家三级药用保护植物，化学成分丰富，如含有黄酮类、生物碱类、挥发油类等物质[1]，具有清热解毒、消肿散结等作用，且种植广泛。其黄酮类物质不仅可以清除自由基、抗氧化、抗脂质过氧化，治疗高血压、预防心脏病[2]，在化妆品、食品工业中也有很重要的价值。国内外已有关于连翘叶总黄酮提取的研究，主要采用的方法有超声波辅助提取、水酶法协同超声提取、微波辅助提取等；提取工艺研究所用的方法主要为正交试验设计[3-4]、均匀设计法[5]。正交法主要处理离散水平值，不能给出整个区域上的最优值，过于理想，在实际应用中具有一定的局限性；均匀设计法只考虑试验点在试验范围内的均匀散布，主要针对多因素、多水平。响应面分析法可以对多因素通过多元二次回归方程寻找最佳条件，试验设计所得出的结果更贴合实际,目前已被广泛的应用于各种生物化工过程的优化研究中[6-7]。本实验采用了超声波辅助有机溶剂乙醇提取连翘果实总黄酮，通过紫外分光光度法测定其含量。首先对提取温度、超声功率和乙醇浓度进行单因素试验，然后通过响应面法[8]来进行优化，确定最佳提取条件，以为连翘总黄酮的研究与开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料与试剂

连翘采摘于山西省沁水县十里乡，芦丁标准品购于上海永叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.1.2 主要仪器设备

SP-754型紫外可见分光光度计（上海博讯实业有限公司），FA1004万分之一级电子天平（上海舜宇横平有限公司），KQ-400KDE型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），XFB-500中药粉碎机（吉首市中诚制药机械厂），HC-2062型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮的提取和测定

将晒干的连翘果实用中药粉碎机粉碎→过35目筛→取一定量的粉末加乙醇作提取溶剂→在超声波清洗器中提取一定时间→冷却后在离心机上3 000 r/min离心10 min→取其上清液→加亚硝酸钠，放置6 min→加硝酸铝，放置6 min→加氢氧化钠，再用乙醇定容至25 mL容量瓶中，放置10 min→在510 nm处用紫外分光光度计测吸光值。

1.2.2 黄酮提取率的计算

黄酮提取率=ncv/1 000 m

式中：c为从回归方程求得的黄酮的含量(mg/L)，n为提取液稀释的倍数，v为提取液的体积（mL），m为连翘的质量（g），提取率的单位为mg/g。

1.2.3 芦丁标准溶液的配制

称取芦丁标准品5 mg于100 mL烧杯中，用少量60%乙醇溶解后倒入25 mL容量瓶中，反复冲洗烧杯，加60%乙醇定容至刻度，摇匀，即可得到0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液。量取芦丁标准品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于25 mL容量瓶中，分别取5 mL 60%乙醇溶液、5%亚硝酸钠0.3 mL分别于容量瓶中，混匀后静置6 min，加入10%的硝酸铝0.3 mL，混匀再静置6 min，再加入4 mL 4%的氢氧化钠，60%乙醇定容至25 mL，摇匀放置10 min，以芦丁含量为0的相应溶液作空白对照，在510 nm处测定各溶液的吸光值。

1.2.4 单因素试验设计

以连翘总黄酮提取率为指标，研究提取时间、超声功率和乙醇浓度对连翘总黄酮提取率的影响。

1）提取温度：称取5份经粉碎过35目筛的连翘粉末250 mg,于100 mL烧杯中用60%乙醇溶解后倒入15 mL刻度试管中，按料液比1∶30加入60%的乙醇，在60%超声功率条件下，分别在温度为40、50、60、70、80℃的超声波清洗仪中，提取40 min。

2）超声功率：称取5份经粉碎过35目筛的连翘粉末250 mg，于100 mL烧杯中用60%乙醇溶解后倒入15 mL刻度试管中，按料液比1∶30加入60%乙醇，在温度40℃的条件下，分别在30%、40%、50%、60%、70%的超声功率下超声提取40 min。

3）乙醇浓度：称取5份经粉碎过35目筛的连翘粉末250 mg，于100 mL烧杯中用乙醇溶解后倒入15 mL刻度试管中，在料液比1∶30及温度40℃的条件下，分别加入40%、50%、60%、70%、80%浓度的乙醇，60%功率超声提取40 min。

1.2.5 响应面试验设计

根据单因素试验结果，选取3个对黄酮提取率有影响的因素为自变量，分别为提取温度（A）、超声功率（B）、和乙醇浓度（C），每个变量各取3个水平，分别为低、中、高，以-1、0、1进行编码，以黄酮提取率为考察目标，运用Design-Expert软件进行响应面实验设计，设计出响应面实验方案，并对实验结果进行数模分析和优化以确定连翘总黄酮的最佳提取工艺条件。根据中心组合试验设计原理（Box-Behnken），确定响应面试验方案，试验设计因素及水平见表1。

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线的绘制

用x轴表示芦丁浓度C（mg/mL），y轴表示吸光度（A），制作两者关系曲线，结果见图1。回归方程A=7.464 3 C-0.002 3，r=0.999 8。图中显示标准品芦丁在0.008～0.04 mg/mL呈很好的线性对应关系。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 温度对连翘中黄酮提取率的影响

考查提取温度对样品黄酮提取率的影响见图4。可知当温度低于50℃时，随着温度的升高和反应的进行，使更多的黄酮类物质及其分解物渗透到试剂中，从而提取率呈上升趋势；但是当温度高于50℃后，乙醇就会蒸发，浓度相对升高，使得细胞壁中纤维素成分以及细胞中抗氧化活性物质成分易被破坏，多糖、淀粉、脂肪酸、纤维素等杂质的溶出量增加，而黄酮类化合物因发生了水解或其他反应，其溶出也会减少，从而使得提取率下降。见图2。

图2 提取温度对黄酮提取率的影响

2.2.2 超声功率对连翘中黄酮提取率的影响

考查超声功率对样品黄酮提取率的影响见图3。可知当超声功率小于60%时，随着超声功率的增加，黄酮类物质的提取率也随之增加，但超声功率大于60%之后，一方面，植物细胞因震动过速而受到破坏，使得一些物质如多糖、淀粉、脂肪酸、纤维素等的溶解率增加；另一方面，超声功率的增加，仪器内部温度会升高，黄酮类物质可能因与其它物质发生了反应析出减少，提取率下降。

图3 超声功率对黄酮提取率的影响

2.2.3 乙醇浓度对连翘中黄酮提取率的影响

考查乙醇浓度对样品黄酮提取率的影响见图4。可知最优水平为60%，而在其两侧的浓度范围内都是呈单向上升或下降的。这可能是因为乙醇浓度越大，极性越小，黄酮类物质极性越大析出越多，在一定乙醇浓度范围内使其提取率越上升；但是当乙醇浓度超出一定范围时，一方面，多余的乙醇会和黄酮类物质发生一定的反应，另一方面，乙醇极性也会增大，不利于黄酮类物质的溶解析出，故提取率呈下降趋势。

图4 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.3 响应面法优化实验结果与分析

2.3.1 响应面分析因素水平的确立

依单因素的试验结果，对黄酮提取率进行考察，运用Design expert7.0软件程序，采用3因素3水平的响应面分析方法，按照1.2.5试验方案，根据中心组合试验设计原理（Box-Behnken），最终获得响应面试验方案，试验设计因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平

2.3.2 响应面分析实验设计方案及结果

以提取温度（A）、超声功率（B）和乙醇浓度（C）为自变量，以黄酮提取率为响应值（Y），应用Design-Expert软件对试验结果进行分析，试验方案及数模分析结果见表2。

表2 响应面分析方案及试验结果

2.3.3 多元二次响应面回归模型的建立和分析

利用Design-Expert软件对表2的结果进行响应面分析，拟合3个因子最终构建多元二次响应面回归模型：

Y=15.07+0.095A+0.26+0.13C+0.44AB+0.047AC+0.13BC-1.20A2-1.72B2-1.45C2。为检验模型的有效性，对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3 二次响应面回归模型方差分析

从表3可知，二次响应面模型为显著模型（P＜0.001），且通过P值可知模型中变量C、A2、B2、C2对Y值的影响非常显著，说明试验因子与响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大关系，交互作用的影响相对较小，这和模型回归中的线性和平方项影响显著相对应。

从表3中还可以看出，影响连翘中黄酮提取率的各因素按影响大小排列顺序依次为B（超声功率）、C（乙醇浓度）、A（提取温度）。该模型是显著的（P ＜ 0.001），方程中C、A2、B2、C2对Y值的影响非常显著，表明试验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大关系，交互作用的影响相对较小，这和模型回归中的线性和平方项影响显著相对应。

从表3中还可以看出，影响连翘中黄酮提取率的各因素按影响大小排列顺序依次为B（超声功率）、C（乙醇浓度）、A（提取温度）。

2.3.4 曲面图和等高值线图的分析

为了进一步探究提取温度、超声功率、乙醇浓度的交互作用对Y响应值的影响，利用Design-Expert软件绘制等高值线图和三维响应面曲面图，见图5～7。由图可知，A、B、C对Y影响大小，由等高线图得到最优条件下各因子的取值决定。图5表示在提取时间为40 min，超声功率为60%情况下，提取温度和超声功率之间的交互作用响应面图，图6表示在提取时间为40 min，超声功率为60%情况下，提取温度和乙醇浓度之间的交互作用响应面图，图7表示在提取时间为40 min，超声功率为60%情况下，超声功率和乙醇浓度之间的交互作用响应面图。

图5 提取温度和超声功率对黄酮提取率影响的响应面图

图6 提取温度和乙醇浓度对黄酮提取率的响应面图

图7 超声功率和乙醇浓度对黄酮提取率的响应面图

由于椭圆和线间疏密程度反映了2变量交互作用的大小，椭圆形和线间距离越密，则表示交互作用大，椭反之越小；同理，曲面倾斜程度越大，交互作用亦大，反之则小。结合图及P值分析可知，A、B、C间对响应值均有交互作用，其中B（超声功率）、C（乙醇浓度）的交互作用较为明显。

2.3.5 最佳提取条件的确定

由响应面法分析数据可得出连翘中黄酮最佳提取工艺为：温度57.2℃，超声功率66.2%，乙醇浓度56.2%，理论最佳提取率为15.08%。通过3次验证试验，求得平均值为14.77%，该值与理论值相差0.3%，在误差允许范围内，说明响应面法优化连翘中黄酮提取工艺可在实际应用中应用。

3 结论

通过对提取时间、超声功率和乙醇浓度的单因素实验，筛选出对连翘总黄酮提取率影响较大的3个因素：温度、超声功率、乙醇浓度；在此基础上，以连翘总黄酮提取率为响应值，选3个因素为自变量水平，用Design-Expert软件处理并最终确定连翘中黄酮类成分最佳提取工艺为：温度57.2℃，超声功率66.2%，乙醇浓度56.2%。响应面分析法巧妙地规避了正交设计的缺陷，可以对各个因素进行更加全面、细致的分析，研究各个因素之间的相互关系，可以比较准确地分析出因素间的最佳组合，比正交设计更直观、理想。

[1]段文娟,耿岩玲,祝贺,等.中药连翘化学成分和分析方法的研究进展[J].山东科学,2010,23(2)：33-37.

[2]冯卫生,赵献敏,王彦志,等.正交设计优选卷柏中总黄酮的提取工艺研究[J].中草药,2009,40(6)：893-896.

[3]吴艳芳,王新胜,尹延彦,等.超声辅助提取连翘总黄酮工艺条件优化[J].中国实验方剂学杂志，2011,17（14）：30-32.

[4]旷超阳,欧阳玉祝,陈实.水酶法协同超声提取连翘总黄酮工艺优选[J].食品与发酵科技，2012,48（1）：49-51.

[5]彭艳红,李嫦玲,刘新义.均匀设计法优选连翘超微粉碎工艺的研究[J].药物评价研究,2013(01)：45-47.

[6]杨芳,杨万林,陈锦玉.苦荞壳总黄酮超声辅助醇提工艺的优化[J].食品与机械,2015(05)：234-238

[7]单斌,张卫国,谢建华.响应面法优化超声辅助提取苦瓜多糖工艺的研究[J].食品与机械,2009(01)：76-80.

[8]王润梅,张永芳,胡猷浩.响应面分析法优化北芪菇多糖提取工艺研究[J].食品工业,2015,36（2）：68-71

Optimization of Extraction for Total Flavonoids in Forsythia Suspensa by Response Surface Methodology

WANG Run-mei，ZHANG Yong-fang，LIU Li-min，LIU Rui，GUO Xiao-feng
(School of Life Science,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009)

Response surface analysis methodology was used to optimize the extraction technology of total flavonoids from Forsythia suspensa in order to get the best extraction conditions.The total flavonoids were extracted by organic solvents ethanol ultrasound-assisted method with Forsythia suspensa.Temperature,ultrasonic power and ethanol concentration were selectded to do the single factor,experiment.According to the principle of the Box-Benhnken,response surface methdology was employed to determine the response surface experimental program and make the response surface results.Finally the best extraction conditions were determined by the Design-Expert analysis software program.Optimal extraction conditions were as follows：temperature of 57.2 ℃,ultrasonic power of 66.2%,ethanol concentration of 56.2%,Under such conditions,the extraction rate was 15.08%and verifier of optimal extraction yield was 14.77%.The result was of important practical significance for the further development and application.

forsythia suspensa；total flavonoids；response surface methodology；optimization

R284.2

A

1674-0874(2017)02-0050-05

〔责任编辑 杨德兵〕

2016-10-23

山西大同大学青年研究项目[同大科字20138号]。

王润梅（1963-），女，山西大同人，硕士,教授，研究方向：生物化学。