紫草对重症急性胰腺炎肺损伤的实验研究

刘斌焰,刘斌钰,李 祥,邢雁霞,郭敏芳,刘 宏

（山西大同大学生命科学学院，山西大同037009）

紫草对重症急性胰腺炎肺损伤的实验研究

刘斌焰,刘斌钰,李 祥,邢雁霞,郭敏芳,刘 宏∗

（山西大同大学生命科学学院，山西大同037009）

目的观察紫草对大鼠重症急性胰腺炎（SAP）肺组织病理变化及血清TNF-α、IL-6和NO的影响。方法选用Wistar大鼠随机分为假手术组（NS组）、模型组（SAP组）、紫草3 g/kg（H-紫草组）和紫草1 g/kg组（L-紫草组），检测术后24 h和72 h肺组织病理变化及血清TNF-α、IL-6和NO水平。结果 H-紫草组和L-紫草组死亡率明显低于SAP组；H-紫草组和L-紫草组NO活性较高与SAP组相比P〈0.01；而血清TNF-α和IL-6的含量显著降低，与SAP组比较。肺组织病理变化：SAP组可见肺间质充血、水肿，炎性细胞浸润严重，肺泡腔部分融合成肺大泡。H-紫草组和L-紫草组大鼠肺组织炎症反应明显较模型组减轻。结论紫草能降低SAP大鼠死亡率，提高血清NO活性、降低TNF-α和IL-6含量，减轻SAP所致的肺损伤。

紫草；重症急性胰腺炎(SAP)；一氧化氮（NO）；肿瘤坏死因子（TNF-α）；白细胞介素-6（IL-6）；

重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)以并发症多、预后差、病变发展快、死亡率高为临床特点[1]。SAP致病机制尚不明了，与胰的自身消化有关，常并发全身炎症反应综合征（SIRS），甚至多器官功能障碍综合征(MODS)而死亡。早期以肝、肾和肺等胰外器官的损伤最为常见，超过50%的SAP患者会出现严重的肺部并发症[2-4]。SAP约80%的死因与急性肺损伤(acute lung injury，ALI)的病变过程相关[5]。目前中药已成为治疗SAP的常规方法[6]。紫草是传统中草药，最初记载于《神农本草经》，是紫草科（Boraginaceae）多年生草本植物，新疆紫草或内蒙紫草的干燥根。新疆紫草称软紫草，在我国有悠久的药用历史，其味甘咸，性寒，具有凉血活血，解毒透疹之功用[7]；中药紫草用于治疗感染炎症性的疾病已有上千年记载，课题组前期研究发现紫草对SAP合并的肝肾损伤有比较好的疗效[8]，本课题探讨紫草对SAP合并肺损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验药物

紫草购于大同市思迈乐药店；浸泡，水煎，过滤浓缩成1∶1药液（每mL含生药1 g），4℃冰箱保存备用。用时分别配成60%和20%的水溶液，按照5 mL/kg给予。

1.2实验动物

Wistar大鼠，体质量350 g左右，由山西医科大学动物中心提供，生产许可证号：SCXK(晋)2014-001。

1.3试剂

牛磺胆酸钠为美国Sigma公司产品；肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）试剂盒为上海西塘公司产品；一氧化氮（NO）试剂盒为南京建成产品。

1.4方法

取Wistar大鼠60只，随机分为4组，假手术组（NS组），仅行开腹术并只轻翻动胰腺数次后关腹,模型组(SAP组)、紫草3 g/kg（H-紫草组）和紫草1 g/kg组（L-紫草组），均制成SAP模型,用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后，常规备皮，正中开腹，用小动脉夹夹闭胆管出肝门处，1 mL注射器针头经十二指肠大乳头逆行向胆胰管内匀速注入5%牛磺胆酸钠（0.4 mL/kg），等2 min后，取下小动脉夹，拔出微量注射器，缝合腹壁。制成重症急性胰腺炎模型[9]。术后H-紫草组和L-紫草组立即分别给予3 g/kg和1 g/kg紫草，每日2次灌胃；SAP组和NS组分别给予NS做对照，每日观察大鼠情况并继续给药。

1.4.1生化指标检测

分别在术后不同时间取血分离血清，用双抗体夹心法(ELISA)法测定血清TNF-α和IL-6含量；采用硝酸还原酶法测定NO。检测方法按测试盒说明书进行测定。

1.4.2组织标本制备

各组于术后24 h和72 h取肺组织，置10%中性甲醛液固定1 d，常规制成石蜡块切片，苏木精—伊红（HE）染色，供病理检测。

1.4.3统计学处理

采用SPSS统计软件19.5处理实验数据并用均数±标准差（±s）表示，计量资料用F检验,死亡率用χ2检验，以P〈0.05作为显著性差异的标准。

2 结果

2.1肉眼观察

NS组大鼠在1 d后活动与进食趋于正常；模型组大鼠出现倦卧、少动、食量减少、呼吸急促、精神低靡、背毛蓬松失去光泽等表现，部分大鼠可见胰腺出血严重甚至坏死；H-紫草组和L-紫草组大鼠在2 d后活动与进食开始增加。解剖可见NS组大鼠胰腺无充血水肿，肺颜色正常，质软富弹性。SAP组，肺充血肿胀呈暗红色，有大量黄色腹水，紫草组的组织损伤较SAP组有所减轻。

2.2死亡率比较

NS组全部存活。1 d的死亡率：SAP组55.56%(10/18)，H-紫草组16.67%(3/18)，L-紫草组27.78%（5/18），χ2=5.89 P 〈 0.05，χ2=2.85，P＞0.05。3 d的死亡率：SAP组88.89%(16/18)；H-紫草组27.78(5/18)，L-紫草组50.00%(9/18)，χ2=13.83，χ2=6.42，P〈0.01，紫草能降低SAP大鼠死亡率。

2.3 紫草对SAP大鼠血清TNF-α、IL-6和NO的影响

H-紫草组和L-紫草组NO水平较高、TNF-α和IL-6比较低，与SAP组比较P〈0.01；结果见表1、表2。

表1 紫草对SAP大鼠血清TNF-α和IL-6含量变化的影响（n=7）

表2 紫草对SAP大鼠血清NO含量变化的影响/μmol·L-1

2.3.1血清TNF-α和IL-6的测定结果

血清TNF-α和IL-6的检测，采用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）试剂盒。在酶标仪上测定（测定波长为450 nm）血清中TNF-α和IL-6含量，OD值的测定需要在加入终止液中止反应后10 min之内完成测定。结果见表1。

从表1可见，24 h血清TNF-α含量比72 h高，而IL-6则相反；SAP组大鼠血清TNF-α和IL-6含量最高，紫草3 g/kg组和紫草1 g/kg组与模型组比较有统计学意义P〈0.01。

2.3.2血清NO测定结果

采用硝酸还原酶法测定NO，结果见表2。

从表2可见，H-紫草组和L-紫草组NO水平较高，与SAP组比较（P〈0.01）；

2.4肺组织在光镜下的病理改变

以肺组织中性粒细胞浸润作为观察指标。发现NS组大鼠肺组织结构清晰，无中性粒细胞浸润。模型组炎性细胞浸润严重，肺泡腔部分融合成肺大泡，有局灶性出血。紫草组大鼠肺组织有炎性细胞浸润，但比模型组轻。结果见图1。

图1 术后1、3 d 4组大鼠肺组织形态学变化（×200）

3 讨论

自1998年Rindernecht提出了SAP的“白细胞过度激活”学说以来，一直认为SAP的发生发展与炎性细胞的激活及炎症因子的释放有关。TNF-α是引起ALI的关键性炎症介质，在SAP病变的早期就升高，与SAP的严重程度和死亡率成正相关，因此临床把TNF-α作为判定其严重程度及预后的指标[10]。TNF-α具有多种生物学效应，能促进IL-6、IL-8等炎性细胞的合成和释放，引起“瀑布”效应，进而造成SIRS和MODS等严重后果[11]。因此炎症反应的有效调控也成为AP肺损伤防治的研究热点。

IL-6是又一个关键性的炎症介质，参与SAP的急性期发热等反应，IL-6能促进TNF-α的释放，TNF-α又能诱导IL-6的合成和释放，形成恶性循环，导致胰腺组织出血坏死，AP病情加。因此IL-6可作为早期评价AP严重程度的重要指标[12]。

本研究显示SAP组血清的TNF-α和IL-6水平显著增高,肺镜下可见间质性水肿和炎性细胞浸润等特征性病理变化。紫草能降低SAP死亡率，与SAP组比较P〈0.01；紫草明显降低血清TNF-α和IL-6含量，与SAP组比较P〈0.01；肺炎性细胞浸润紫草组亦比模型组轻。

近年来研究发现，NO在SAP的发病机制中有重要的作用。NO能明显减轻胰和肺的病变，对SAP并发ALI具有一定的治疗作用[13]。在各种应激状态下,NO对改善机体的微循环发挥了非常重要的作用，表现为扩血管改善微循环，抑制血小板(blood platelet，PLT)和白细胞(white blood cell，WBC)在内皮细胞表面的黏附、聚集,预防血栓形成，还能抑制弥散性血管内凝血（DIC）和炎性细胞的浸润[14]。本研究显示紫草能增加SAP大鼠血清NO水平，改善胰腺血管微循环，对大鼠SAP合并肺损伤具有保护作用。

紫草使SAP大鼠血清NO水平升高，显著降低TNF-α和IL-6含量，使肺组织炎性细胞浸润减少，从而减轻SAP肺组织的损伤，有效降低死亡率，其机制可能与改善微循环，降低炎性细胞的激活，减少炎症因子的释放有关，进而对SAP引起的肺损伤有保护作用。

[1]中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组，《中华胰腺病杂志》编辑委员会，《中华消化杂志》编辑委员会.中国急性胰腺炎诊治指南(2013，上海)［J］.中华胰腺病杂志，2013，13(2)：73 － 78．

[2]Shields C J，Winter D C，Redmond H P．Lung injury inacute pancreatitis：mechanisms，prevention，and therapy[J]．Curr Opin Crit Care，2002，8(2)：158 － 163．

[3]刘斌焰，刘斌钰，李祥，等.低分子量肝素对重症急性胰腺炎大鼠肝组织的影响[J].现代预防医学，2014，41（3）：516-519.

[4]Zhao X，Andersson R，Wang X，et al．Acute pancreatitis associated lung injury：pathophysiological mechanisms and potential future therapies[J].Scand J Gastroenterol，2002，37(12)：1351 － 1358．

[5]王泽普，脱红芳，彭彦辉.急性胰腺炎并发急性肺损伤机制及干预的研究进展 [J].广东医学，2015，36（24）：3874-3876.

[6]段炼，魏毅涛，刘曼玲.中草药对急性肺损伤的保护机制研究进展 [J].医学研究生学报，2016，29（5）：533-536.

[7]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1977.

[8]刘斌焰,刘斌钰,李祥,等.紫草对重症急性胰腺炎肾组织的影响[J].中药药理与临床，2013，29（3）：119-122.

[9]刘斌焰，闫军.低分子量肝素对重症急性胰腺炎干预的实验研究[J].中国自然医学杂志，2010；12（2）：8183－8114

[10]王治伟，迟琼.急性胰腺炎患者血清TNF-α、IL-6及hs-CRP水平变化及临床意义[J].白求恩军医学院学报,2012,10(2)：85-87.

[11]段文涛,马海,杨红春，等.重症急性胰腺炎患者血清TNF-α、IL-6、PAF的临床意义[J].中华临床医师杂志(电子版)，2013，7（17）：8014-8015.

[12]孙红双，吕菁君，魏捷.急性肺损伤发病机制及治疗的未来研究趋势[J].医学研究杂志，2016，45（1）：181-183.

[13]于春林，张国志.一氧化氮对急性胰腺炎影响的研究进展[J].实用药物与临床，2016，19（7）：909-912.

[14]马燕，姜辉，汪永忠.疏肝利胆颗粒对急性胰腺炎大鼠的保护作用[J].中药药理与临床，2012，28（3）：103－105

The Experimental Study of Lithospermum on Lung Injury in Severe Acute Pancreatitis

LIU Bin-yan,LIU Bin-yu,LI Xiang,XING Yan-xia，GUO Min-fang,LIU Hong
（School of Life Science,Shanxi Datong University，Datong Shanxi,037009）

ObjectiveTo investigate the effect of Lithospermum on the pathological changes in lung tissue and TNF-α、IL-6、NO in serum induced by severe acute pancreatitis(SAP).MethodsWistar rats were randomly divided into four groups：sham operation group,model group,3g/kg Lithospermum treatment group and 1g/kg Lithospermum treatment group.The pathological changes in lung tissue and TNF-α、IL-6、NO in serum were detected at 24h and 72h after surgery.All experiment datas were showed by means± standard deviation.ResultsThe mortality of rat in 3g/kg Lithospermum treatment group and 1g/kg Lithospermum treatment group was significantly lower than that in the model group（p〈0.01）；The activity of NO were higher in 3g/kg Lithospermum treatment group and 1g/kg Lithospermum treatment group was significantly lower than that in the model group（p〈0.01）；The level of TNF-α and IL-6 in serum were decreased significantly than model group（p〈0.01）；The pathological changes in lung tissue：,massive alveolar interstitial tissue edema,hemorrhage,and inflammatory cell infiltration were observed in model group,part of alveolar fused into bullae of lung.The inflammatory response of the lung in Lithospermum treatment group was more alleviated than in the model group.Conclusion Lithospermum can reduce mortality of Rat with SAP,increase the activity of NO,inhibit the level of TNF-α and IL-6,reduce lung injury induced by SAP.

lithospermum;severe acute pancreatitis(SAP)；NO;tumor necrosis factor-a(TNF-α);interleukin-6(IL-6)

R657.5；R285.5

A

〔责任编辑 杨德兵〕

1674-0874(2017)01-0038-03

2016-09-23

山西大同大学科研资助项目[2013K2]；山西大同大学大学生创新一般资助项目[XDC2016201]；山西省大同市科技公关资助项目[2016100]

刘斌焰（1979-），男，山西大同人，硕士，讲师，研究方向：胰腺炎的基础研究；∗刘宏,男，博士，教授，通信作者。