高效液相色谱法测定帕布昔利布含量

史校东，范 甜，姚 军,2

(1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省药用分子化学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，河北石家庄 050018)

高效液相色谱法测定帕布昔利布含量

史校东1，范 甜1，姚 军1,2

(1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省药用分子化学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，河北石家庄 050018)

为建立帕布昔利布(PD)含量测定方法，采用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent HC C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(二者体积比为300∶700，含0.1%(体积分数)三氟乙酸)，流速为1.0 mL/min，按照等度洗脱，进样量为10 μL，检测波长为234 nm，柱温为40 ℃。结果表明：主药与各杂质之间分离度良好；帕布昔利布质量浓度在50～150 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好，r为0.999 5；仪器精密度、中间精密度、稳定性试验的RSD值小于2.0%；帕布昔利布回收率为100.0%，RSD值为0.8%(n=9)。本方法可以准确快速测定PD含量，有效排除其他外界因素的影响，为帕布昔利布原料药含量测定提供新的参考。

色谱分析；帕布昔利布；高效液相色谱法；含量测定；方法学验证

图1 帕布昔利布结构式Fig.1 Structural formula of PD

帕布昔利布(palbociclib，PD)，结构式见图1，是由辉瑞制药有限公司(Pfizer)研发的用于治疗乳腺癌的药物[1]，美国食品药品监督管理局(FDA)对该药给予了突破性治疗认定和优先审评，2015年2月PD在美国经批准上市[2]。PD是细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6的选择性抑制剂[3]，通过恢复细胞周期控制、阻断肿瘤细胞增殖[4]。联合来曲唑作为以内分泌治疗为基础的初始方案用于治疗 ER+/HER2-绝经后晚期乳腺癌[5]。实验结果显示，接受 PD 的患者 PFS(无进展生存期)值为 26.1个月，相比之下安慰剂组仅7.5个月[6]。

目前，中国药典及外国药典未收录测定帕布昔利布原料含量的方法，在已公布的专利中，也未查询到相关含量的检测条件。文献[7]公开了一种羟乙基磺酸盐帕布昔利布的制备方法，文献[8]公开了一种高纯度帕布昔利布及其反应中间体的制备方法，文献[9]公开了一种帕布昔利布药物组合物及其制备方法，文献[10]公开了一种帕布昔利布胃漂浮片及其制备方法，文献[11]公开了一种帕布昔利布原料有关物质的检测方法。此外，文献[12—14]也未对帕布昔利布原料的含量检测方法进行详细研究及阐述。本文建立了一种帕布昔利布含量的测定方法，实际应用表明该方法可以准确快速测定PD含量，有效排除其他外界因素的影响，通过对含量的测定更好地控制产品质量[15]，为帕布昔利布原料药含量测定提供新的参考[16]。

1 主要仪器与试药

2695-2996型HPLC仪，包括2695分离单元、2996二极管阵列检测器(美国Waters公司提供)；XA-105U型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司提供)；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵(河南省巩义市英峪高科仪器厂提供)。

帕布昔利布对照品(自制，纯度为99.7%)；帕布昔利布原料药(实验室自制，规格为0.125 g)；乙腈，色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent HC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(二者体积比为300∶700， 含0.1%(体积分数，下同)三氟乙酸)，按照等度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为234 nm，柱温为40 ℃，进样量为10 μL。

2.2 溶液配制

1)供试品溶液 称取本品25 mg，置于25 mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容。再精密量取5 mL，置于50 mL容量瓶中，用稀释剂定容，质量浓度为0.1 mg/mL。

2)对照品溶液 称取帕布昔利布对照品25 mg，置于25 mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容。再精密量取5 mL，置于50 mL容量瓶中，用稀释剂定容，质量浓度为0.1 mg/mL。

3)空白溶剂 0.1 mol/L盐酸-乙腈(二者体积比为700∶300)。

2.3 制备方法

帕布昔利布对照品(自制)是由C13H13BrClN3O和C14H22N4O2为原料合成的，合成路线见图2。

图2 帕布昔利布合成路线Fig.2 Synthetic route of PD

2.4 检测结果

经红外、核磁共振、质谱分析，可判定自制对照品为目标产物，相关数据见表1—表4。

表1 核磁共振氢图谱数据

表2 红外图谱数据与解析

表3 核磁共振碳图谱数据

表4 质谱图谱数据

2.5 系统适应性

2.5.1 系统适用性试验

进样对照品溶液10 μL，考察PD峰拖尾因子及理论板数。连续进样5针对照品溶液，考察PD峰面积的相对标准偏差，5针的峰面积分别为2 238 754，2 245 695，2 239 651，2 245 695，2 254 870，平均峰面积为2 244 933，峰面积的 RSD值为0.3%(<2.0%)，拖尾因子为1.3(<2.0)，理论板数为134 567(>2 500)， 符合系统适用性试验要求。

2.5.2 专属性试验

取帕布昔利布原料20 mg，精密称定，置于20 mL的量瓶中，对其进行酸破坏、碱破坏、氧化破坏和高温破坏等。峰纯度检测试验数据见表5。

表5结果表明，帕布昔利布正常样品及降解样品的纯度角均小于纯度阈值，峰纯度符合要求。

2.5.3 线性关系考察

取帕布昔利布对照品，按对照品溶液质量浓度的50%～150%(相当于含PD 0.05 ～0.15 mg/mL)，分别配制5个不同水平(分别为50%，80%，100%，120%，150%)的溶液作为线性试验溶液，每个浓度水平的溶液分别连续进样2针，记录色谱图。以质量浓度x(μg/mL)为横坐标、峰面积y为纵坐标进行线性回归。线性回归方程为y= 21 404x+ 44 064，r=0.999 5，截距为44 064，符合线性试验要求。

表5 峰纯度检测试验数据

2.5.4 进样精密度试验

取“2.2”项下帕布昔利布对照品溶液，精密量取10μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录峰面积。5针的峰面积分别为2 238 754，2 245 695，2 239 651，2 245 695，2 254 870，平均峰面积为2 244 933，帕布昔利布峰面积的RSD值为0.3%(<2.0%)，说明进样的精密度良好。

2.5.5 重复性试验

称取同批帕布昔利布原料适量，精密称定，加空白溶剂溶解并稀释制成1mL中含有帕布昔利布0.1mg的溶液，平行配制6个样品溶液进行检测，记录峰面积。重复性试验结果见表6。

表6 重复性

由表6结果可知，帕布昔利布峰面积的RSD值 为0.1%，说明重复性良好。

2.5.6中间精密度试验

按“2.5.5”项下方法，另配制6个供试品溶液， 由不同的分析人员，在不同的日期、使用不同的仪器 进行检测，记录峰面积。中间精密度结果见表7。 由表7结果可以看出，重复性与中间精密度共 12次进样的RSD值为0.18%，说明本方法的中间 精密度良好。

2.5.7 稳定性试验

按照“2.2”项下配制供试品溶液及对照品溶液 各2份，于室温条件下密闭放置至少24h后取出， 作为测试溶液。分别精密量取10μL，按“2.1”项下色谱条件进样，考察放置后对照品溶液和供试品溶液的含量(质量分数，下同)，结果见表8。

由表8结果可知，对照品溶液和供试品溶液在室温条件下密闭放置24 h后稳定。

表8 溶液稳定性考察数据

2.5.8 回收率试验

制备含有帕布昔利布为规定限度的80%(0.08 mg/mL)，100%(0.1 mg/mL)，120%(0.12 mg/mL)的测试溶液，每个质量浓度平行制备3份，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。用对照品溶液按外标法计算溶液中含有的帕布昔利布的实际浓度，以此浓度与理论浓度比较，计算9个样品的平均回收率及9个回收率的RSD值，结果见表9。

由表9可知，单个回收率范围为98.92%～101.26%，平均回收率为100.0%(n=9)，RSD值为0.8%(n=9)。结果表明此方法的准确度较高。

2.5.9 耐用性试验

改变含量测定色谱条件中的柱温(±5 ℃)、流速(±0.2 mL/min)、流动相比例(±20 mL)、三氟乙酸比例(±0.01)和色谱柱(不同批次)，分别测定同一批样品，耐用性试验结果见表10。结果表明方法的耐用性良好，适用本品检测。

表9 回收率试验结果(n=9)

表10 耐用性试验结果

2.6 样品测定

对本方法分别进行了专属性、线性范围、准确度、精密度、溶液稳定性、方法耐用性等方法学研究。结果表明，本方法准确可行。取3批样品适量，分别按“2.2”项下的方法制备供试品溶液和对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。样品含量测定结果见表11。由表11可知，3批样品含量均在99.0%以上，符合规定。

表11 样品含量测定结果

3 讨 论

3.1 色谱条件的优化

前期试验中，参考相关文献[17—21]可知帕布昔利布溶于酸性溶液，采用甲醇-水(二者体积比为450∶550，含0.1%三氟乙酸)为流动相时，出峰时间较快，主峰与其中一个杂质分离度不符合要求。为改善主峰与杂质间的分离度，将甲醇更换为洗脱能力更强的乙腈，同时调节乙腈的比例，使乙腈与水的体积比为300∶700(含0.1%三氟乙酸)，结果发现主峰与杂质间的分离度满足要求，主成分峰的峰形良好，理论板数较高。色谱图比较见图3。

图3 色谱图比较Fig.3 Comparison of chromatograms

3.2 色谱柱的选择[22-23]

分别对安捷伦公司Agilent HC-C18柱、Agilent TC-C18柱、Thermo-Fisher公司Hypersil BDS C18柱(规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm)共3根色谱柱进行考察[19-21]。按照“2.1”项下色谱条件进行检测。结果表明，Hypersil BDS C18柱对主成分及杂质的分离不是很好，Agilent HC-C18柱、Agilent TC-C18柱对主成分及杂质均能良好分离。

3.3 检测限的确定

将线性项下溶液稀释，根据帕布昔利布和各个杂质峰的s/n来确定LOD，检测限试验数据见表12。由表12可知，最终检测限为0.005。

表12 检测限试验数据

4 结 语

帕布昔利布是一种全新结构的化学合成抗癌药物，具有非常广阔的临床应用前景。国内外有关帕布昔利布含量测定的相关报道较少，影响到该药品的质量监测和使用。目前国内外对于帕布昔利布的药理作用和合成方面的研究较为深入，因此完善帕布昔利布含量的测定方法将有助于提高帕布昔利布药理试验结果的准确性，同时也有利于对帕布昔利布展开多方面的研究。

本文采用高效液相色谱法对帕布昔利布进行含量测定，由于色谱条件中流动相的酸性较大(pH值在2.3左右)，需要选择耐酸的色谱柱，因而有一定的局限性，但是此法操作简便、快速、规范，结果准确可靠，可以更好地控制帕布昔利布原料药的质量。今后还要进一步考察帕布昔利布含量测定的影响因素试验，同时也需展开关于帕布昔利布有关物质、残留溶媒等方面的研究。

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Determination of palbociclib by high performanceliquid chromatography

SHI Xiaodong1， FAN Tian1， YAO Jun1,2

(1.School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang，Hebei 050018, China; 2.State Key Laboratory Breeding Base-Key Laboratory of Molecular Chemistry for Drug of Hebei Province, Shijiazhuang, Hebei 050018, China)

In order to establish an HPLC method for the content determination of palbociclib, HPLC is performed on the column of Agilent C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)with the mobile phase of acetonitrile-water (300∶700，0.1% TFA included) at the flow rate of 1.0 mL/min, with the sample size of 10 μL, the detection wavelength of 234 nm and the column temperature of 40 ℃. The result shows that the main drug and the related substances could be well separated; the calibration curve of palbociclib is in good linearity over the range of 50～150 μg/mL, andr=0.999 5; the RSD of instrument precision, intermediate precision and stability test of related substances and content are no more than 2.0%; the average recovery is 100.0% with RSD of 0.8% (n=9). The method can rapidly and accurately determine the PD content, effectively eliminate the effects of other external factors. It provides a new reference to the content determination of active pharmaceutical ingredients.

chromatography； palbociclib； HPLC； assay； methodology validation

2017-05-03；

2017-05-29；责任编辑：张士莹

石家庄市科学技术研究与发展计划项目(161200223A)

史校东(1992—)，女，河北保定人，硕士研究生，主要从事药物分析方面的研究。

姚 军教授。E-mail：twobright@163.com

1008-1542(2017)04-0375-08

10.7535/hbkd.2017yx04009

TQ460.7；R917

A

史校东，范 甜，姚 军.高效液相色谱法测定帕布昔利布含量[J].河北科技大学学报,2017,38(4):375-382. SHI Xiaodong，FAN Tian，YAO Jun.Determination of palbociclib by high performance liquid chromatography[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2017,38(4):375-382.