石荠苧提取物的体外抑菌作用及抗氧化活性研究

黄树平，文莉，黄程程，王志刚，徐超，李霞辉，舒刚*

(1.眉山职业技术学院农业技术系，四川眉山620010;2.四川农业大学动物医学院，四川成都611130)

石荠苧提取物的体外抑菌作用及抗氧化活性研究

黄树平1，文莉2，黄程程2，王志刚2，徐超2，李霞辉2，舒刚2*

(1.眉山职业技术学院农业技术系，四川眉山620010;2.四川农业大学动物医学院，四川成都611130)

为研究石荠苧提取物的体外抑菌作用和抗氧化活性，分别用水和无水乙醇提取石荠苧活性成分，并对乙醇总提取物依次用石油醚、氯仿、正丁醇进行分步萃取，得到不同极性的各部分提取物，分别采用管碟法、倍比稀释法测定沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对提取物的敏感性，同时采用DPPH法和Fenton法研究不同溶剂萃取的提取物的体外抗氧化活性。结果表明，石荠苧水提液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均有抑制作用，最小抑菌浓度(MIC)分别为15.63、125.00、125.00 mg/mL，最小杀菌浓度(MBC)分别为31.25、250.00、250.00 mg/mL;乙醇总提取物对金黄色葡萄球菌有抑制作用，MIC、MBC分别为125.00、250.00 mg/mL。氯仿萃取物、正丁醇萃取物、乙醇总提取物、水提液清除DPPH·的IC50分别为422.5、425.8、413.4、611.4 mg/mL，其中乙醇总提取物清除作用最强;氯仿萃取物、正丁醇萃取物、乙醇总提取物、水提液清除·OH的IC50分别为542.2、577.1、925.5、781.2 mg/mL，其中正丁醇萃取物清除能力最强。综上，石荠苧提取物对细菌有抑制作用和抗氧化作用。

石荠苧;提取物;抑菌;抗氧化

Key words:Scabrous mosla;extract;antibacterium;antioxidation

近年来，由于抗生素在畜禽养殖中的滥用导致药物残留和耐药性问题日益严重，天然药物的研究开发和利用成为热点［1］。国外出现了日益重视药用植物的趋向，而我国是世界上植物资源最丰富的国家之一［2-3］，深入研究药用植物有效成分的作用，积极开拓植物提取物资源在动物保健中的应用具有重要意义。

石荠苧(Scabrous mosla)系长唇形科植物，多年生草本，主要分布在长江流域以南地区［4］。临床上用于治疗感冒、中暑、疟疾、便秘和慢性支气管炎等［5］。石荠苧提取物可显著改善流感病毒感染小鼠的病理状态，延长其存活时间，提高机体免疫水平［6］。曾晓艳等［7］研究表明，苏州石荠苧的水提液具有一定的抑菌作用。苏州石荠苧中黄酮类成分含量丰富，而黄酮类成分具有清除自由基、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗衰老等药理作用［8-10］。

目前，对于石荠苧在动物保健中的应用研究较少，为此，提取石荠苧活性成分，探究其提取物的体外抑菌活性及其体外抗氧化活性，以期为石荠苧作为动物药的开发、应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

LDZX－50FBS高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)、恒温培养箱(宁波东南仪器有限公司)、旋转蒸发仪(巩义市英峪高科仪器厂)、ESJ200－4A电子分析天平(沈阳龙腾电子有限公司)、UV－2000型紫外分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)、SHZMD型循环水多用真空泵(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试验材料与试剂

石荠苧采自重庆市北碚歇马镇，经四川农业大学范巧佳副教授鉴定为石荠苧。大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、沙门氏菌(C79－13)均购自中国兽药监察所。

肉汤培养液、普通营养琼脂、MH培养基均购自青岛海博生物公司;DPPH、水杨酸、30%H2O2、Fe-SO4、茶多酚、石油醚、正丁醇、无水乙醇、氯仿均为分析纯，购自成都科龙化工试剂公司。

1.3 试验方法

1.3.1 石荠苧不同提取物的制备称取石荠苧全草粗粉50 g，加4倍体积水煎煮3次，每次15 min，过滤，合并滤液，浓缩至50 mL，得到水提液备用。

称取石荠苧全草粗粉300 g，置于烧杯中，加入1 800 mL 95%乙醇浸没药材，用保鲜膜封口后浸泡12 h，于超声清洗仪中振荡提取30 min，冷却过滤后得到石荠苧乙醇总提取物，用旋转蒸发仪进行减压回收，得乙醇总浸膏，真空干燥后密闭保存。

将上述提取得到的乙醇总提取物，加水溶解至50 mL，置于250 mL分液漏斗中，依次用石油醚、氯仿、正丁醇各50 mL萃取3次。分别合并萃取液后，使用旋转蒸发器减压回收各部分溶剂，依次得到石油醚萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水部位浸膏，于烘箱中烘干，称质量后密闭保存备用。提取流程如图1所示。

图1 石荠苧不同提取物制备流程

1.3.2 抑菌作用的测定在无菌操作的条件下，挑取培养18～24 h纯培养菌落4～5个。接种于3～5 mL水解酪蛋白(MH，0.5麦氏单位)肉汤中，37℃培养6～8 h，用无菌生理盐水或MH肉汤校正菌液浊度，使其与标准比浊管的浊度相同。

体外抑菌试验采用管碟法［11-12］。用无菌棉签蘸取浓度为107～108cfu/mL的细菌稀释液，涂布于普通营养琼脂平板上，用无菌镊子将牛津杯均匀摆放在平板上，静置10～15 min后滴加石荠苧各提取物，加至液面与牛津杯表面平行即可，分别用相应萃取试剂作对照。将平板37℃培养18～24 h，用游标卡尺测量抑菌圈大小。试验结果判定标准:抑菌圈直径大于20 mm为高度敏感，10～19 mm为中度敏感，小于10 mm为低度敏感［12］。

1.3.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定用MH肉汤将抗菌药物稀释成不同质量浓度之后，再接种待测菌，定量测定提取物的MIC［13-14］。取96孔板，每孔加营养肉汤0.1 mL，第1管加供试液0.1 mL，混匀后取0.1 mL于第2管，混匀后吸取0.1 mL于第3管，依次类推到第9管，弃去0.1 mL，第10管改加0.1 mL无菌生理盐水作为对照，然后每管内加入细菌悬液0.1 mL混合均匀，37℃培养24 h。结果判定依据:肉汤清亮透明表示细菌不生长，肉汤浑浊表示有细菌生长。以能抑制细菌生长的提取物的最低剂量为其MIC［15］。

1.3.4 最小杀菌浓度(MBC)的测定从1.3.2所述无菌生长的肉汤中吸出0.1 mL滴入平板中，涂布均匀。然后将各平皿放入恒温培养箱内37℃培养24 h，观察是否有细菌生长。结果判定依据:以无菌生长对应的提取物最低剂量为其MBC［15］。

1.3.5 体外抗氧化活性的测定将制备得到的石荠苧乙醇总提取物、各极性部分浸膏溶液和水提液分别稀释成5个质量浓度梯度，以同质量浓度的茶多酚为阳性对照，测定各自的DPPH·和·OH清除率。

1.3.5.1 DPPH法参照彭长连等［16］的方法，将5个不同质量浓度的石荠苧提取物样品各2.0 mL置于10 mL试管内，加入2.0 mL浓度为1.52×10－4mol/L的DPPH无水乙醇溶液，充分振荡摇匀，放置30 min。以各个萃取物对应的溶剂为参比溶液，测定样品在517 nm波长处的吸光度Ai。将2.0 mL不同质量浓度的石荠苧乙醇提取物样品溶液与2.0 mL溶剂混合后，测定在517 nm波长处的吸光度Aj。同时测定2.0 mL浓度为1.52×10－4mol/L的DPPH溶液与2.0 mL溶剂混合后在517 nm波长处的吸光度A0。自由基清除率(S0)=［1－(Ai－A0)/Aj］× 100%。以样品对应的萃取溶剂为参比溶液，以同质量浓度的茶多酚为阳性对照，评价样品的体外抗氧化活性，并用GraphPad Prism 5软件分析IC50值 (DPPH吸收50%抗氧化剂的质量浓度)。

1.3.5.2 Fenton法参照范拴喜等［17］的方法，在10 mL试管中分别依次加入1.0 mL不同质量浓度的样品溶液、2.0 mL浓度为1.8 mmol/L的FeSO4溶液、1.5 mL浓度为1.8 mmol/L的水杨酸无水乙醇溶液，混匀，然后向其中加入0.1 mL 0.03%的H2O2，立即混匀，37℃保温30 min，测定其在510 nm波长处的吸光度Aj。以蒸馏水代替0.03%的H2O2，测定其在510 nm处的吸光度Ai。以蒸馏水代替样品，测其在510 nm处的吸光度A0。·OH清除率=［A0－(Aj－Ai)］/A0×100%。以同质量浓度的茶多酚为阳性对照，评价样品抗氧化活性，并用GraphPad Prism 5软件分析IC50值(·OH吸收50%抗氧化剂的质量浓度)。

2 结果与分析

2.1 石荠苧乙醇总提取物及不同极性部分萃取物得率

按照1.3.1提取方法获得乙醇总提取物(12.56 g)及石油醚萃取物(0.81 g)、正丁醇萃取物(0.59 g)、氯仿萃取物(0.44 g)，石油醚、正丁醇和氯仿各部分提取物得率依次为6.4%、4.7%和3.5%。

2.2 石荠苧水提液和乙醇总提取物的体外抑菌效果

2.2.1 不同提取物抑菌效果由表1可知，石荠苧水提液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有一定的抑制效果，抑菌圈大小顺序为金黄色葡萄球菌＞沙门氏菌＞大肠杆菌。乙醇总提取物对金黄色葡萄球菌有抑制作用，对沙门氏菌和大肠杆菌均无抑制作用。金黄色葡萄球菌对石荠苧水提液高度敏感，大肠杆菌和沙门氏菌中度敏感;金黄色葡萄球菌对乙醇总提取物中度敏感。

表1 石荠苧不同提取物对供试菌的抑菌圈直径mm

2.2.2 石荠苧水提液的MIC和MBC由表2可知，石荠苧水提液对金黄色葡萄球菌的MIC为15.63 mg/mL，对大肠杆菌、沙门氏菌的MIC均为125.00 mg/mL。可见，石荠苧水提液对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好。

由表3可知，石荠苧水提液对金黄色葡萄球菌的MBC为31.25 mg/mL，对大肠杆菌、沙门氏菌的MBC均为250.00 mg/mL。可见，石荠苧水提液主要对细菌起抑制作用，而对大肠杆菌、沙门氏菌的抑制作用较弱。

表2 石荠苧水提液的MIC

表3 石荠苧水提液的MBC

2.2.3 石荠苧乙醇总提取物的MIC和MBC由表4、表5可知，石荠苧乙醇总提取物对金黄色葡萄球菌的MIC、MBC分别为125.00、250.00 mg/mL。

表4 石荠苧乙醇总提取物的MIC

表5 石荠苧乙醇总提取物的MBC

2.3 石荠苧不同提取物的体外抗氧化效果

2.3.1 对DPPH·的清除作用由图2可知，石荠苧水提液、乙醇总提取物及不同极性部分萃取物对DPPH·都有一定的清除能力，对DPPH·的清除率总体上随着样品质量浓度的增加先增加后趋于平稳。氯仿萃取物、正丁醇萃取物、乙醇总提取物、水提液的IC50分别为422.5、425.8、413.4、611.4 mg/ mL，其中乙醇总提取物清除作用最强，但均弱于相同质量浓度的茶多酚。当质量浓度为600、800、1 000 mg/mL时，氯仿萃取物、正丁醇萃取物和乙醇总提取物清除率差异均不大，但都弱于茶多酚。当质量浓度为800、1 000 mg/mL时，石荠苧水提液清除率分别为87.2%、86.8%，清除作用与茶多酚相当。

图2 石荠苧不同提取物对DPPH·的清除率

2.3.2 对·OH的清除作用石荠苧水提液、乙醇总提取物及不同极性部分对·OH清除结果如图3所示。石荠苧水提液、乙醇总提取物和不同极性部分萃取物对·OH都有一定的清除能力。除正丁醇萃取物外，总体上其他极性部分萃取物对·OH的清除率均随着样品质量浓度的增加而增加。氯仿低质量浓度(200 mg/mL)萃取物的清除率高于茶多酚，正丁醇萃取物、水提液和乙醇总提取物的清除率均低于茶多酚。氯仿萃取物、正丁醇萃取物、乙醇总提取物、水提液的IC50分别为542.2、577.1、925.5、781.2 mg/mL，其中氯仿萃取物对·OH的清除作用最强。质量浓度为1 000 mg/mL时，水提液的清除率最高，为74.3%，但清除效果弱于茶多酚;质量浓度为200 mg/mL时，正丁醇萃取物清除率为60.8%，高于茶多酚的清除率;质量浓度为400 mg/mL时，正丁醇萃取物达最高清除率(70.8%);当高于该质量浓度时，清除率又随质量浓度的升高而下降。

图3 石荠苧不同提取物对·OH的清除率

3 结论与讨论

3.1 石荠苧提取方法和试剂的选取

在诸多的传统中药提取方法中，水煎煮法是最有代表性、最常用的提取方法［18-19］。水煎煮法提取中药工艺流程步骤简单，可在煎煮过程中获得大部分的有效药物成分。

为提取植物中与抗氧化有关的有效成分，选择适当的提取溶剂十分重要。选择溶剂的依据是相似相溶原则，以最大限度地提取所需要的化学成分，而对共存杂质的溶解度要尽可能小［20］。本试验中所选取的溶剂的极性表现为水＞乙醇＞正丁醇＞氯仿＞石油醚。水的极性大，可提取药材中的苷类、有机酸盐等。但水提取的选择性和针对性均差，容易提取出大量无效成分，影响体外抗氧化能力。乙醇可通过调节其含量，有选择性地提取浸提药材中的某些有效成分。氯仿可以提取出游离生物碱、有机酸、黄酮及香豆素等。用上述不同极性的溶剂对石荠苧进行提取时，各部分提取的物质不尽相同，可以探究其各提取部分的作用效果。

3.2 石荠苧提取物体外抑菌效果

本试验选用常见的动物源致病菌作为研究对象，金黄色葡萄球菌是人类和动物的一种重要病原菌，有“嗜肉菌”的别称［21］;大肠杆菌是禽畜最常见的病原菌之一，可引起腹泻和败血症［22］;而沙门氏菌更是一种常见的食源性致病菌，在细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首［13］。本试验初步证实石荠苧的水提液对这3种细菌均有一定的抑制作用。其中，金黄色葡萄球菌对石荠苧的水提液高度敏感，大肠杆菌和沙门氏菌中度敏感;金黄色葡萄球菌对乙醇总提取物中度敏感。水提液的抑菌作用与刘胜贵等［15］报道结果一致。

3.3 石荠苧提取物对自由基的清除作用

评价中草药抗氧自由基活性的方法主要有化学发光法、分光光度法和电子自旋共振法等，DPPH法是较常用的方法之一。DPPH·是一种稳定的自由基，其醇溶液呈深紫色，在517 nm处有一吸收峰。当反应系统中存在自由基清除剂时，它可以和DPPH·的单电子配对而使517 nm处的吸收峰渐渐消退。而且，这种颜色变浅的程度与配对电子数呈化学计量关系［23］。因此，根据消退速度和峰值改变程度可以检测自由基的清除情况，从而评价试验样品的抗氧化能力。张海涛等［24］以无水乙醇为提取试剂，在石荠苧质量浓度为100、10、1 mg/mL时测定的DPPH的清除率分别为94.88%、68.50%、44.18%。吕佩惠等［25］研究表明，石荠苧属植物自由基清除率与各提取物总黄酮含量呈正相关，其中，水提取物的自由基清除率均大于71%，75%乙醇提取物的自由基清除率大于75%。

本试验结果表明，石荠苧水提液、乙醇总提取物及不同极性部分萃取物均有较好的体外抗氧化活性。石荠苧水提液、乙醇总提取物及不同极性部分萃取物对DPPH·和·OH都有清除作用，特别是氯仿萃取物和正丁醇萃取物对DPPH·和·OH的清除作用比较明显，可能与富含多酚、黄酮等有效物质密切相关［9］。综上，石荠苧水提液和醇提取物在体外对细菌有一定的抑制作用和抗氧化作用。

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Study on Antibacterial and Antioxidant Activity of Extract from Scabrous mosla in Vitro

HUANG Shuping1，WEN Li2，HUANG Chengcheng2，WANG Zhigang2，XU Chao2，LI Xiahui2，SHU Gang2*
(1.Department of Agricultural Technology，Meishan Vocational and Technical College，Meishan 620010，China; 2.College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China)

In order to study the antibacterial and antioxidant activity of the extracts from Scabrous mosla，active components of Scabrous mosla were extracted by water and ethyl alcohol，and the ethanol extract were abstracted again with petroleum ether，chloroform，n-butanol successively for different polar extracts.Then susceptibility tests of Salmonella，E.coli and Staphylococcus aureus with pipe plate and doubling dilution method were conducted，and DPPH and Fenton method were used to research the antioxidant activity of extraction in different menstrua.The results showed that water extracts had antibacterial effect on Salmonella，E.coli and Staphylococcus aureus，with the MIC of 15.63，125.00，125.00 mg/mL and the MBC of 31.25，250.00，250.00 mg/mL.Ethyl alcohol extract had antibacterial effect on Staphylococcus aureus with MIC of 125.00 mg/mL and MBC of 250.00 mg/mL.The IC50of extraction of chloroform，n-butanol，ethyl alcohol and water were 422.5，425.8，413.4，611.4 mg/mL，respectively.The IC50of extraction of chloroform，n-butanol，ethyl alcohol and water were 542.2，577.1，925.5，781.2 mg/mL，respectively.In conclusion，the extracts from Scabrous mosla had good antibacterial and antioxidant activities.

S853.75

A

1004－3268(2017)07－0115－06

2017－01－05

四川省科技厅苗子工程项目(035Z1143)

黄树平(1965－)，男，四川眉山人，副教授，本科，主要从事畜禽养殖研究。E－mail:cndyx2005@163.com

*通讯作者:舒刚(1978－)，男，重庆铜梁人，副教授，博士，主要从事中药药理与药剂研究。E－mail:dyysg2005@sicau.edu.cn