花吊丝竹ISSR反应体系的建立与优化

瞿印权，徐雯，沈露，何天友，施成坤，荣俊冬，陈礼光，郑郁善*

(1.福建农林大学林学院，福建福州350002;2.福建农林大学艺术学院园林学院，福建福州350002; 3.福建省东山赤山国有防护林场，福建漳州363400)

花吊丝竹ISSR反应体系的建立与优化

瞿印权1，徐雯1，沈露1，何天友2，施成坤3，荣俊冬1，陈礼光1，郑郁善1*

(1.福建农林大学林学院，福建福州350002;2.福建农林大学艺术学院园林学院，福建福州350002; 3.福建省东山赤山国有防护林场，福建漳州363400)

建立关于花吊丝竹的ISSR－PCR反应体系，为花吊丝竹种质资源鉴定提供理论基础。采用单因素试验法，对影响PCR扩增效果的Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度及模板DNA用量等5个PCR反应体系主要成分以及退火温度和循环次数进行分析，并利用建立的优化反应体系和扩增程序对100条候选引物进行筛选。结果表明，适合花吊丝竹的ISSR－PCR反应体系为:20 μL的反应液中含3.0 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTPs、1.25 U Taq DNA聚合酶、0.6 μmol/L引物、10 ng模板DNA、2 μL 10×Buffer、8.55 μL ddH2O。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s，52.7℃退火30 s，72℃延伸90 s，40个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。建立的花吊丝竹的ISSR－PCR反应体系能够扩增出清晰、多态性较高的条带，且筛选出的16条引物具有高度多态性。表明该体系具有较高的稳定性、重现性和适用性。

花吊丝竹;ISSR;反应体系;优化

花吊丝竹(Dendrocalamus minor var.amoenus)属于竹亚科(Bambusoideae)牡竹属(Dendrocalamus)的丛生竹，主要生长于我国广东、广西、贵州等地。因其杆有异色条纹，外形美观，可作庭园观赏竹，亦可劈篾编结竹席、箩筐等竹器［1］。丛生竹林在生物固碳领域也有巨大作用［2］，同等面积下的竹林较树林可多释放出35%的氧气，具有很好的生态效益［3］。

ISSR(inter-simple sequence repeat)是在SSR序列的基础上，加上1～4个核苷酸作为ISSR－PCR反应的引物，从而使得DNA序列放大，表现出较高的重复性和稳定性［4］。SSR序列在高等生物的染色体内广泛存在，所以利用ISSR技术可以得到较多的分子标记，呈现出较高的多态性［5］。ISSR分子标记技术具有稳定性好、重现性好、多态性好、产物特异性强的特点［6］，现已广泛应用于植物的种质收集、品种鉴定、遗传作图、基因定位、标记辅助选择等诸多领域［7-8］。本研究采用单因素试验方法对花吊丝竹ISSR－PCR扩增反应体系中的主要组成成分(Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA)的浓度或含量进行筛选优化，建立花吊丝竹ISSRPCR反应的最佳体系，为花吊丝竹地理种源的遗传多样性分析、亲缘关系的鉴定和指纹图谱的构建奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

2016年9月，于福建省漳州市东山赤山国有防护林场花吊丝竹地理种源试验样地采集幼嫩叶片，尽快转移至－80℃冰箱保存，以备DNA的提取。

1.2 主要试剂与仪器

所用Taq DNA聚合酶、dNTPs Mixture、Mg2+、RNA降解酶、DNA Ladder Marker、10×PCR Buffer、6×Loading Buffer均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;琼脂糖、核酸染料均购自北京赛西盛公司。引物参考哥伦比亚大学公布的100条引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取与检测采用博日公司Biospin植物基因组DNA提取试剂盒从花吊丝竹的叶片中提取DNA，用紫外分光光度计检测其浓度、纯度，再用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性及是否有降解现象。

1.3.2 原初扩增程序和反应体系设定的原初扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。原初扩增反应体系(20 μL)含2.5 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、1 U Taq DNA聚合酶、0.6 μmol/L引物、50 ng模板DNA、2 μL 10×Buffer、9.8 μL ddH2O。原初扩增程序和反应体系均参考李炎梅［9］的方法。

1.3.3 ISSR引物的初选经过初步的引物筛选，引物UBC845能产生清晰度高、多态性好的条带，故可以用于ISSR－PCR体系的筛选(图1)。

图1 ISSR部分引物初始筛选

1.3.4 ISSR－PCR扩增体系的优化采用单因素试验法，对影响PCR反应的Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度、模板DNA用量5个组成因素进行优化筛选(表1)并建立最优反应体系。

1.3.5 退火温度和循环次数的筛选一般引物的退火温度要求低于理论退火温度5℃［10］，因此，设置退火温度最低为50℃，最高为60℃。利用PCR仪自动对退火温度生成12个梯度，循环次数分别设置为30、35、40次。在建立的最优反应体系中筛选出最佳退火温度和最佳循环次数。

1.3.6 ISSR有效引物的筛选利用优化的反应体系及扩增程序，用提取出的花吊丝竹基因组DNA，分别与100条引物进行PCR扩增，筛选条带清晰、丰富的引物。

1.3.7 ISSR－PCR扩增体系的检测取9 μL的PCR产物与1.5 μL 6×Loading Buffer混匀，上样到加有核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶中，电泳1 h，电压设为5 V/cm。待电泳结束，用紫外凝胶成像分析仪观察和拍照。

表1 扩增体系单因素筛选

2 结果与分析

2.1 Mg2+浓度对ISSR－PCR扩增的影响

由图2可见，Mg2+浓度为1.0、1.5、2.0 mmol/L时，均无扩增条带出现。当Mg2+浓度为2.5 mmol/L时，开始出现扩增条带，但扩增出的条带较少且模糊。Mg2+浓度为3.0～4.0 mmol/L时，扩增条带数目基本一致，但Mg2+浓度在2.5 mmol/L时，高分子量区域的条带更为清晰。因此，反应液中Mg2+最佳浓度定为3.0 mmol/L。

图2 不同浓度Mg2+对ISSR－PCR扩增的影响

2.2 dNTPs浓度对ISSR－PCR扩增的影响

由图3可见，0.05 mmol/L的dNTPs扩增的条带数量较少，且不够清晰。0.10 mmol/L dNTPs扩增条带数增多，但条带较暗，且高分子量的扩增条带较模糊。0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L dNTPs扩增结果相似，扩增条带清晰，条带明亮。与0.15 mmol/L相比，0.20～0.30 mmol/L dNTPs扩增的条带在高分子量区域更加清晰。0.35 mmol/L dNTPs扩增的条带在中等分子量区域较清晰、明亮，但低分子量的扩增条带出现弥散、背景增强现象。同时也考虑到尽量降低试验成本，在扩增效果好的浓度范围内，选择用量较少的dNTPs浓度(0.20 mmol/L)。

图3 不同浓度dNTPs对ISSR－PCR扩增的影响

2.3 Taq DNA聚合酶用量对ISSR－PCR扩增的影响

由图4可见，当Taq DNA聚合酶用量为1.25 U时，高分子量条带较清晰，且扩增出的条带多态性好。1.25、1.50、1.75 U的Taq DNA聚合酶的扩增结果类似，条带清晰、明亮。当Taq DNA聚合酶用量大于1.75 U时，高分子量条带的扩增效率下降，条带模糊。同时考虑到试验成本，最后确定Taq DNA聚合酶最佳用量为1.25 U。

2.4 引物浓度对ISSR－PCR扩增的影响

由图5可见，0.3 μmol/L的引物扩增的条带数不够清晰，且扩增出非特异性条带。0.4、0.5、0.6 μmol/L的引物扩增结果类似，扩增条带清晰、明亮，且0.6 μmol/L的引物扩增的条带最为清晰。当引物浓度大于0.6 μmol/L时，中等分子量条带依然清晰，但高分子量条带的扩增效率下降，直至无扩增条带，且在低分子量区域出现背景弥散现象。最后确定0.6 μmol/L的引物浓度为ISSR－PCR反应体系的最佳浓度。

图4 不同用量Taq DNA聚合酶对ISSR－PCR扩增的影响

图5 不同浓度引物对ISSR－PCR扩增的影响

2.5 模板DNA用量对ISSR－PCR扩增的影响

一般情况下，模板DNA含量过低会导致无扩增产物，过高则会引起非特异性产物的出现或扩增条带模糊［11］。少数情况下，模板DNA用量对ISSRPCR扩增影响不大［12］。由图6可见，本试验设计的7个梯度水平的DNA用量均能扩增出清晰、明亮的条带且无明显差异。考虑到DNA用量越少越好，因此本试验选择模板DNA用量为10 ng。

图6 不同用量模板DNA对ISSR－PCR扩增的影响

2.6 扩增程序参数的筛选

利用建立的最优扩增体系，对UBC845引物的退火温度进行梯度筛选。由图7可见，当退火温度为50.0～52.7℃时，扩增结果相似，条带清晰明亮且数量较多。当退火温度大于52.7℃时，扩增条带清晰度明显降低，条带数逐渐减少。当扩增结果相近时，为提高反应的特异性，优先选择相对较高的退火温度［13］。因此，选择52.7℃作为反应的最佳退火温度，相比其理论退火温度Tm值，下浮5～10℃，与沈洁等［14］的研究结果相一致。

循环次数对PCR反应有重要的影响，循环次数太少会导致扩增产物少。循环次数太多又会产生非特异性扩增产物［15］。由图8可见，当循环次数为40次时，扩增条带最为清晰。所以选择40次循环作为花吊丝竹ISSR－PCR反应的最佳循环次数。

图7 退火温度对ISSR－PCR扩增的影响

2.7 ISSR有效引物的筛选

由图9可见，利用所建立的体系，对100条引物进行扩增，最终筛选出16条多态性较好的引物。绝大部分都能扩增出清晰、明亮的条带，少部分引物不能扩增出条带。说明本试验所建立的花吊丝竹的最佳反应体系稳定，并具有重复性。

图8 循环次数对ISSR－PCR扩增的影响

图9 ISSR有效引物的筛选

3 结论与讨论

分子标记技术是一种能快速将特定的DNA片段进行大量复制的技术。能在遗传物质本身DNA水平上检测分析到遗传变异［16］。ISSR分子标记技术试验操作简单、快速、高效，利用该技术能检测出扩增产物较丰富的多态性位点［17］。ISSR分子标记技术在遗传多样性分析、种质资源评价、指纹图谱构建等方面应用广泛。

本研究利用优化的最佳反应体系，从100条引物中筛选出16条清晰、明亮且扩增条带数较多的引物。试验结果说明，该反应体系具有较高的稳定性、重现性、标记位点清晰和扩增产物多样性等优点。

扩增体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度、模板DNA用量等因素对花吊丝竹ISSR－PCR反应有关键性影响，每一种因素的变化都有可能导致结果不同，因此确定一个理想的最优反应体系对ISSR－PCR反应是很重要的。本试验发现，dNTPs浓度直接影响产物的产量和特异性［18］，dNTPs浓度过低会导致底物与引物的酶促反应速度的下降，扩增条带产率低、效果差，dNTPs浓度过高会使得Mg2+浓度降低，从而抑制Taq DNA聚合酶的活性，导致扩增条带模糊。因此，当dNTPs、Mg2+浓度控制在一定比例内，才能达到最好的试验效果［19］。Taq DNA聚合酶用量过多会引起扩增条带模糊，过低则会使得扩增产物减少［20］。引物的浓度过高时容易引起引物二聚体的形成，从而导致扩增条带模糊或减少，还会产生新的非特异性位点;过低则会使PCR反应提前结束，使扩增条带减少甚至没有条带出现［15］，还会导致非特异性条带的产生。Mg2+浓度会极大地影响Taq DNA聚合酶活性，Mg2+浓度过低，会使Taq DNA聚合酶的活性下降，从而使得扩增产物减少甚至没有扩增产物［21］。一般情况下，DNA含量过高，会增加非特异性扩增或造成弥散型产物;而含量过低，与引物的结合概率就低，表现为无扩增产物或扩增结果不稳定［22］，而本试验发现，不同DNA含量的扩增结果无明显差异。

扩增程序中的退火温度过高，会使得PCR引物与模板结合差，出现电泳条带减弱和条带数减少现象。同一种引物在不同植物的ISSR－PCR扩增中的最佳理论退火温度也不相同［10］，如引物845在本试验花吊丝竹ISSR－PCR扩增反应中的最佳退火温度为52.7℃，而在苦瓜的ISSR－PCR扩增程序中的最佳退火温度为52.0℃［23］。引物的退火温度是有限度的，只能在引物理论退火温度上下浮动5～10℃，提高退火温度可以增加扩增产物的特异性，但当退火温度升高到一定值时，扩增条带便减弱、减少。

本试验建立的关于花吊丝竹的优化体系为: 20 μL的反应液中含3.0 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTPs、1.25 U Taq DNA聚合酶、0.6 μmol/L引物、10 ng模板DNA、2 μL 10×Buffer、8.55 μL ddH2O。退火温度为52.7℃，循环次数为40次。研究结果为花吊丝竹不同地理种源的遗传多样性研究和亲缘关系评价奠定了技术基础。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1996.

［2］Xiang T，Ying Y，Teng J，et al.Sympodial bamboo species differ in carbon bio-sequestration and stocks within phytoliths of leaf litters and living leaves［J］.Environmental Science and Pollution Research，2016，23(19):1-9.

［3］王娟.13种观赏竹种引种驯化研究［J］.世界竹藤通讯，2016，14(5):4-7.

［4］何天友.短葶山麦冬的遗传多样性分析及ISSR指纹图谱构建［D］.福州:福建农林大学，2011.

［5］McGregor C E，Lambert C A，Greyling M M，et al.A comparative assessment of DNA fingerprinting techniques (RAPD，ISSR，AFLP and SSR)in tetraploid potato(Solanum tuberosum L.)germplasm［J］.Euphytica，2000，113(2):135-144.

［6］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprintingby simple sequence repeat(SSR)anchored polymerase chainreaction amplification［J］.Genomes，1994，20(2): 176-183.

［7］钱书，葛颂，洪德元.采用RAPD和ISSR标记探讨中国疣粒野生稻的遗传多样性［J］.植物学报，2000，42 (7):741-750.

［8］赵谦，庄东红，杜虹，等.ISSR在蝴蝶兰亲缘关系分析中的初步应用［J］.汕头大学学报(自然科学版)，2007，22(4):66-70.

［9］李炎梅.竹亚科各属命名种遗传多样性的ISSR分析及原理应用研究［D］.福州:福建农林大学，2012.

［10］Zhan Z Y，Xu G B.Establishment and optimization of ISSR-PCR system for Liriodendron［J］.Journal of Central South University of Forestry and Technology，2010，30 (6):80-84.

［11］徐奭，张耀川，李树成，等.银杏ISSR－PCR扩增反应体系的建立与优化［J］.生物技术通讯，2012，23(1): 80-85.

［12］吴鑫，雷天刚，何永睿，等.柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化［J］.分子植物育种，2008，6(1):170-176.

［13］张杨，张朝贤，王金信，等.牛筋草ISSR－PCR反应体系的建立与优化［J］.植物保护，2012，38(3):90-94.

［14］沈洁，丁小余，丁鸽，等.铁皮石斛居群差异的研究ⅡISSR指纹标记方法的建立与优化［J］.中国中药杂志，2006，31(4):291-294.

［15］廖丽，郭巧生.夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化［J］.中草药，2009(7):1131-1135.

［16］Bornet B，Branchard M.Nonanchored inter simple sequence repeat(ISSR)marker:Reproducible and specific tools for genome fingerprinting［J］.Plant Mol Biol，2001，19:209-215.

［17］Arnheim N，Erlich H.Polymerase chain reaction strategy［J］.Annual Review of Biochenistry，1992，61:131-156.

［18］钱志瑶，周道堂，黄秀平，等.黔产宽叶缬草ISSR反应体系的建立与优化［J］.生物技术通报，2015，26(7): 69-75.

［19］何海燕，沙伟，张艳馥.大豆ISSR－PCR反应体系的优化［J］.大豆科学，2010，29(3):510-513.

［20］刘兴菊，汤新彩，梁海永，等.枣树ISSR反应体系的建立及优化［J］.西北林学院学报，2007，22(5):62-65.

［21］冯夏莲，何承忠，张志毅，等.毛白杨ISSR反应体系的建立及优化［J］.北京林业大学学报，2006，28(3): 61-65.

［22］Hu Y P，Xie X L，Wang L，et al.Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction conditions for Rheum tanguticum［J］.Guihaia，2010，30(1):112-116.

［23］陈龙正，徐海，宋波，等.利用ISSR分子标记鉴定苦瓜杂交种纯度［J］.南方农业学报，2013，44(12): 1949-1953.

Establishment and Optimization of ISSR-PCR System for Dendrocalamus minor var.amoenus

QU Yinquan1，XU Wen1，SHEN Lu1，HE Tianyou2，SHI Chengkun3，RONG Jundong1，CHEN Liguang1，ZHENG Yushan1*
(1.College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China; 2.College of Art＆Landscape Architecture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China; 3.Fujian Chishan State-owned Forest Farm in Dongshan County，Zhangzhou 363400，China)

The purpose of this study was to establish optimized ISSR system for Dendrocalamus minor var.amoenus.The single factor design was applied for optimizing five factors in ISSR amplification system，such as Mg2+，dNTPs，Taq DNA polymerase，primer and template DNA concentration.The results showed that the optimal 20 μL ISSR-PCR reaction system for Dendrocalamus minor var.amoenus contained 3.0 mmol/L Mg2+，0.20 mmol/L dNTPs，1.25 U Taq DNA polymerase，0.6 μmol/L primer，10 ng DNA template，2 μL 10×Buffer，8.55 μL ddH2O.The amplification procedure was as follows: 94℃5 min;94℃45 s，52.7℃30 s，72℃90 s，40 cycles;72℃10 min，4℃for storage.Under this optimal ISSR amplification system，16 primers were screened with high polymorphism from 100 primers.The test showed that the system was stable，reliable and applicative.

Dendrocalamus minor var.amoenus;ISSR;reaction system;optimization

S795

A

1004－3268(2017)07－0086－06

2016－12－20

福建省科技重大专项(2010N5002，2013NZ0001)

瞿印权(1992－)，男，江苏南通人，在读硕士研究生，研究方向:森林培育。E－mail:386142881@qq.com

*通讯作者:郑郁善(1960－)，男，福建福州人，教授，博士，主要从事竹林培育研究。E－mail:zys1960@163.com