松墨天牛ADP核糖基化因子1基因的序列及表达特性分析

陈敬祥，程杰，林同

(华南农业大学林学与风景园林学院，广东广州510640)

松墨天牛ADP核糖基化因子1基因的序列及表达特性分析

陈敬祥，程杰，林同*

(华南农业大学林学与风景园林学院，广东广州510640)

为了探讨Ras基因超家族中ADP核糖基化因子1基因(ARF1)在昆虫生长发育进程中以及在温度胁迫下的表达特性，以松墨天牛为研究对象，从已构建的cDNA文库中筛选到松墨天牛ARF1基因，命名为MaARF1(GenBank:KY368168)，对其进行序列分析以及不同虫态和不同温度胁迫下的表达特性分析。结果显示，MaARF1基因编码区序列长为549 bp，编码182个氨基酸。预测蛋白质二级结构主要由α螺旋与β片层组成，其次是无规则卷曲和β转角。通过DNAMAN软件比对发现，MaARF1与赤拟谷盗ARF1蛋白氨基酸序列完全一致，二者同源性为100%，且存在1个十四酰基化位点(G2)和5个保守域(G1box—G5box)。通过RT－qPCR分析表明，MaARF1的表达量与松墨天牛的完全变态发育相关，各虫态不间断表达，幼虫期在2龄幼虫(L2)、5龄幼虫(L5)中表达量较高，蛹化期间(L5—P0)表达量表现为上升趋势，并在第2天蛹(P2)中达到最大值，羽化期间(P10—A0)表达量表现为下降趋势;MaARF1在不同温度胁迫下均有表达，低温与高温都会导致表达量下调，温度越高或越低，表达量下调越显著。因此，MaARF1可能主要影响松墨天牛蛹化和羽化这2个变态发育关键点，从而影响整个变态发育历程，同时其也可能参与了松墨天牛体内依赖温度的Ca2+信号途径。

松墨天牛;ADP核糖基化因子1;温度胁迫;变态发育;表达特性;RT－qPCR

ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factors，ARFs)为小分子三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白，属于Ras蛋白超家族成员［1-2］。ARFs在生物体中广泛表达，目前，细菌、酵母、植物、无脊椎动物、脊椎动物等生物中的ARFs均已被鉴定［3］。在哺乳动物中，有6种不同分子量的ARFs亚型(ARF1、ARF2、ARF3、ARF4、ARF5和ARF6)得到鉴定［4］。果蝇中有3种ARFs亚型(ARFⅠ、ARFⅡ和ARFⅢ)被鉴定［5］。不管是哺乳动物还是果蝇，研究表明，ARFs在其生长发育期以及各个组织中均有表达［6］。ARFs与ARF类似蛋白除了在真核生物和原核生物中影响胞吐与内吞作用途径中的细胞内囊泡运输外［7］，还在一些寄生性的原生动物中起着重要作用，如ARF类似物与利什曼虫(Leishmania)鞭毛完整性有关［8］。作为ARF基因家族成员之一的ARF1主要调控细胞内囊泡运输，特别地，ARF1在逆向轴浆运输途径中对囊泡形成至关重要［9］。其介导埃及伊蚊(Aedes aegypti)体内与外壳蛋白Ⅰ(coat proteinⅠ，COPⅠ)囊泡运输相关的功能，如调控受体前往细胞膜的靶向作用、调控可溶性蛋白的分泌作用等［10］。对埃及伊蚊注射ARF1的dsRNA后，分析卵巢组织提取物发现，卵黄蛋白原积累变少［11］。ARF1蛋白还参与生物体内线粒体的裂解和融合这一动态平衡过程，此功能独立于囊泡运输作用。在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、哺乳动物、酵母细胞中，ARF1的缺失会导致体内线粒体形态及活性的异常［12］。而且，ARF1蛋白被证实是一种活化信号分子，能提高相应酶的活性，如磷脂酶D、磷脂酰肌醇激酶［13］，ARF1也与依赖于温度的Ca2+信号途径相关［14］，表明ARF1蛋白不仅参与运输，而且充当一种与温度相关的信号转换器。

松墨天牛(Monochamus alternatus)是林业上重要的蛀干害虫，在我国大部分地区均有分布，能危害以马尾松为主的多种松科植物，幼虫、成虫及其体内携带的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)都会对松科植物造成危害，严重时可导致整株植物死亡［15-16］。为了探讨ARF1在松墨天牛整个完全变态发育进程中的表达特点以及温度是否会影响其表达，从松墨天牛cDNA文库［17］中筛选出ARF1基因序列并进行生物信息学分析，然后研究其在不同时空及温度胁迫下的表达特性，为深入开展昆虫ARF1基因研究以及解析温度胁迫下该基因在昆虫体内充当的功能角色提供分子信息和参考。

1 材料和方法

1.1 松墨天牛ARF1基因筛选及其编码氨基酸序列分析

从已构建好的松墨天牛cDNA文库［17］中筛选出ARF1基因完整编码序列，在NCBI网站上运用Nucleotide Blast程序进行鉴定。

用NCBI在线工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)搜索ARF1基因开放阅读框(ORF)，ProtScale程序分析其编码蛋白的疏水性，SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)预测编码蛋白的信号肽，NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)预测编码蛋白的磷酸化修饰位点，NetOGlyc 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)分析编码蛋白的N－糖基化修饰位点，TMHMM 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)分析编码蛋白的跨膜结构，SOPMA软件(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)预测编码蛋白的二级结构，SWISS－MODEL软件(http://beta.swiss-model.expasy.org/)预测编码蛋白的三级结构并进行同源建模。

1.2 ARF1蛋白氨基酸序列同源性比对

从NCBI数据库中在线检索不同物种ARF1蛋白氨基酸序列，下载后用DNAMAN软件进行多序列同源性比对。

1.3 试验材料及其处理

松墨天牛幼虫采自广州市从化区风云岭森林公园，在避光的人工气候箱内饲养至蛹、成虫，饲养条件:温度为(25±1.0)℃，相对湿度为75%±5%，对幼虫给予人工饲料［18］进行饲养，为成虫提供新鲜的1、2年生马尾松枝条。

虫态样品处理:选取松墨天牛各虫龄虫体3头进行清洗、消毒、麻醉，用磷酸盐缓冲液冲洗后，将样品分别置于无菌去酶的EP管中，立即液氮冷冻，放入－80℃低温冰箱中保存备用。温度胁迫后虫态样品处理:各选取5龄幼虫3头分别置于45、35、25、15、5、－5、－15℃下进行处理，1 h后直接将其置于－80℃低温保存。

1.4 RNA的提取及反转录

用总RNA提取试剂盒(E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ，OMEGA公司)提取上述松墨天牛样本的总RNA，具体操作按该试剂盒说明书进行。用1%琼脂糖凝胶电泳与微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000)分别检测其质量和浓度，检测合格后放入－80℃超低温冰箱保存备用。按反转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa公司)说明书的操作步骤进行单链cDNA的合成，将cDNA稀释10倍后用作实时荧光定量PCR (qPCR)的反应模板，置于－20℃保存备用。

1.5 qPCR分析

通过qPCR(SYBR Green法)检测ARF1基因的表达量。ARF1基因扩增的上游引物为5'－CTCATCTTCGCCAACAAACA－3'，下游引物为5'－GTGGCCTGGATGTACCAGTT－3';内参基因β－actin扩增的上游引物为5'－CTCTGCTATGTAGCCCTTGACTT－3'，下游引物为5'－GGAGTTGTAGGTGGTTTCGTG－3'。采用实时荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM，TaKaRa公司)操作，反应体系(20 μL):SYBR Premix 10 μL、ddH2O 7.2 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 2 μL。反应程序: 95℃预变性5 min;95℃解链10 s，60℃退火、延伸20 s，共40个循环。在LightCycler 480荧光定量PCR仪上进行qPCR反应，每个cDNA样品做3个复孔，设置ddH2O为阴性对照，反应结束后分别采集目标基因(ARF1)和内参基因(β－actin)的Ct平均值，使用2－ΔΔCt法进行相对定量分析。用SPSS 18.0软件的单因素方差分析法(ANOVA)对qPCR数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 松墨天牛ARF1基因序列及其编码氨基酸序列分析

从前期构建的松墨天牛cDNA文库中筛选出一个具有完整编码序列(CDS)的基因，在NCBI网站上运用Nucleotide Blast程序进行不同物种间核苷酸序列比对后，将其鉴定为松墨天牛ARF1基因，命名为MaARF1(GenBank:KY368168)，其CDS长度为549 bp，共编码182个氨基酸残基，预测的蛋白质分子质量为20.65 ku，pI为6.15，脂肪系数为95.93，不稳定系数为21.52，预测其为稳定蛋白。磷酸化修饰位点和N－糖基化修饰位点预测结果表明，苏氨酸磷酸化位点有4个，丝氨酸磷酸化位点有3个，酪氨酸磷酸化位点有3个，N－糖基化修饰位点有1个(图1)。用ProtScale程序进行MaARF1蛋白的疏水性分析发现，该蛋白质氨基酸大部分为亲水性，说明此蛋白质为亲水蛋白;通过SignalP 4.1 Server软件在线预测结果表明，该蛋白质无信号肽;运用TMHMM 2.0 Server软件在线预测发现，该蛋白质无跨膜结构，表明其为非跨膜蛋白。

图1 MaARF1基因序列及其编码的氨基酸序列

2.2 松墨天牛ARF1蛋白的高级结构分析

运用SOPMA在线软件对MaARF1蛋白进行预测，结果表明，该蛋白质的二级结构由α螺旋、β片层、无规则卷曲、β转角组成，分别占39.01%、28.02%、20.88%、12.09%，由此可以推测，MaARF1蛋白的二级结构元件主要由α螺旋和β片层构成。采用蛋白质同源建模法，将MaARF1蛋白氨基酸序列提交SWISSMODEL进行蛋白质三级结构预测，结果同样显示，此蛋白质主要由α螺旋与β片层组成。同时该蛋白质包括3个效应结构域，即Switch 1、interswitch、Switch 2，且N端与C端各有1个α螺旋(图2)。

2.3 松墨天牛ARF1蛋白的同源序列比对

分析表明，MaARF1与赤拟谷盗ARF1蛋白氨基酸序列完全一致，二者同源性最高，为100%;与同为鞘翅目的红斑尼葬甲同源性也非常高，为99%;与鳞翅目、双翅目、膜翅目、半翅目的其他9种昆虫同源性均在96%～98%;此外，与人的ARF1蛋白同源性也达到了96%。通过MaARF1与其他物种(包括11种昆虫和人)的序列比对(图3)发现，MaARF1蛋白存在5个保守域:G1box(G24-LDAAGKT31)、G2box(T48)、G3box(D67VGG70)、G4box(N126KQD129)、G5box(C159AT161)。氨基酸序列第2位甘氨酸(G2)为十四酰基化位点，该位点在各ARF中高度保守。

图2 MaARF1蛋白三级结构预测

图3 MaARF1蛋白与其他物种ARF1蛋白氨基酸序列同源性比对

2.4 MaARF1基因的表达分析

从图4可以看出，MaARF1在松墨天牛各虫态中不间断广泛表达。幼虫期，表达量在1龄幼虫(L1)中最低，为对照(5龄幼虫)的0.36倍，在2龄幼虫(L2)中达到最大值，为对照的1.18倍;化蛹期间(L5—P0)表达量呈现上升趋势，由5龄幼虫(L5)的1.00倍上升到过渡态蛹(P0)的1.75倍，并在第2天蛹(P2)中达到最大值，为对照的4.29倍;羽化期间(P10—A0)表达量呈现下降趋势，由第10天蛹(P10)的0.85倍迅速降低为过渡态成虫(A0)的 0.20倍，之后在第1天(A1)、第2天(A2)成虫中有所上升，分别为对照的0.30、0.32倍。

从图5可以看出，MaARF1在不同温度胁迫下均有表达。其在适宜生长温度(25℃)下表达量最大，在低于25℃的15、5、－5、－15℃胁迫下，表达量逐渐下降，分别为对照(25℃)的0.34、0.20、0.08、0.02倍，各胁迫温度下表达量差异均达显著水平。在高于25℃的35、45℃胁迫下，MaARF1表达量也呈下降趋势，分别为对照(25℃)的0.06、0.05倍，两者之间差异不显著。

图4 MaARF1基因在松墨天牛各虫态中的表达量

图5 不同温度胁迫下MaARF1基因的表达量

3 结论与讨论

与其他同属于Ras蛋白超家族的成员不同，ARFs的N端存在1个两性的α螺旋，这对于ARFs的生物学功能至关重要［19］。ARFs在生物进化过程中处于高度保守状态，如N末端的第2位甘氨酸被十四酰基化修饰，该修饰不仅与ARFs的细胞膜融合相关，而且还能起到调控核苷酸交换的作用［20］。ARF的高级结构也是高度保守的，含有Switch 1、interswitch、Switch 2三个效应结构域，其中interswitch结构由β2、β3片层连接组成［21］。它们构象的变化与GTP和GDP结合相关，同时ARF的N端呈两性，为构象变化创造了条件。当N端的两性α螺旋发生延伸，interswitch结构中会有2个氨基酸残基也随之迁移，从而能实现ARFs的非活性构象(GDPARF复合体)转换成活性构象(GTP－ARF复合体)［22］。通过氨基酸同源比对及保守区域分析发现，除了上述N端两性的α螺旋、十四酰基化修饰位点(G2)和3个效应结构域(Switch 1、interswitch、Switch 2)外，MaARF1还存在5个与GTP解离和结合的保守域［23］(G1box—G5box)，其中GTP结合相关位点中，G2box(T48)、G3box(D67VGG70)保守域被认为是Mg2+结合位点，调控GTP与Mg2+的结合; G4box(N126KQD129)、G5box(C159AT161)保守域与鸟嘌呤环的结合有关。GTP解离相关位点为G1box (G24LDAAGKT31)，在正常的Ras蛋白超家族成员中，该保守域的第3位甘氨酸对GTP解离起着决定性的作用，如果该位点的甘氨酸被其他氨基酸置换，会导致GTP的解离作用受到强烈抑制。但在ARF家族所有成员中，该位点上的氨基酸是天冬氨酸，GTP的解离作用受抑制，这也证实了ARFs蛋白没有GTP酶活性［24］。MaARF1蛋白与12种不同物种ARF1蛋白的同源性高达96%～100%，另外，结合其具有保守的N端两性α螺旋、十四酰基化修饰位点(G2)、3个效应结构域(Switch 1、interswitch、Switch 2)、5个与GTP解离和结合的保守域(G1box—G5box)，可以推测MaARF1属于Ras蛋白超家族下的ARF家族成员。

ARF1作为ARF家族成员之一，其主要功能是调控生物体囊泡运输［9］，囊泡运输与ARF所处结合状态有关，ARF存在2种结合状态:GDP－ARF复合体和GTP－ARF复合体［25］。GTP－ARF复合体会使ARF处于激活态，招募COPⅠ聚集在细胞膜表面，形成COPⅠ出芽小泡来运输蛋白质受体或者可溶性蛋白，随后GTP水解成GDP，形成GDP－ARF复合体，使ARF处于钝化状态，最终导致COPⅠ小泡的分解，完成一次运输［10，26］。Isoe等［11］在研究埃及伊蚊体内与吸血性相关的COPⅠ囊泡运输作用是否受ARF1和ARF4的调控中发现，给予埃及伊蚊糖分饲养，通过RNAi技术单独注射ARF1或ARF4的dsRNA(1 000 ng)，并未导致虫体显著死亡;但同时注射ARF1(500 ng)和ARF4(500 ng)时，虫体死亡速度加快，并且死亡率显著升高;给予埃及伊蚊血液饲养，通过RNAi技术抑制COPⅠ基因的表达后虫体也会出现相似的死亡。这些结果表明，ARF1和ARF4两者均与吸血性埃及伊蚊中肠组织中COPⅠ囊泡运输有关。COPⅠ囊泡运输直接取决于GTP的合成与水解速度，而与之相关的酶在合适温度下才能最大程度地发挥其活性，所以囊泡运输的快慢取决于温度。通过对不同温度胁迫下MaARF1表达分析可知，MaARF1在低于或者高于正常生长温度(25℃)时，随温度下降或升高，其表达量呈下降趋势。推测温度的下降或升高直接影响GTP水解酶与合成酶的活性，从而影响囊泡运输，导致MaARF1的表达量降低。Leber等［27］研究表明，ARF1在Ca2+信号传导方面有潜在的激活作用。ARF1还与依赖温度的Ca2+信号途径相关，且随着温度升高，ARF1的表达量下降［14］。破坏酵母的ARF1可能会产生对寒冷比较敏感的arf1突变体［28］。因此，推测MaARF1可能还参与松墨天牛体内依赖温度的Ca2+信号途径。

ARF1蛋白广泛存在于包括昆虫在内的真核生物中［3］。Ackema等［12］研究ARF1蛋白与线粒体形态和功能的关系表明，其与生物体内线粒体的裂解和融合这一动态平衡相关，并且独立于囊泡运输功能，ARF1的缺失会导致线粒体形态及活性的异常。MaARF1的表达模式研究结果显示，该基因在松墨天牛幼虫期、蛹期和成虫中不间断表达。幼虫期，MaARF1在5龄幼虫中的表达量较之前升高，分析其原因，5龄幼虫为松墨天牛末龄幼虫，而后蜕皮进入蛹期，这一期间需要通过线粒体的裂解与融合动态过程来提供大量能量，暗示MaARF1可能参与松墨天牛5龄幼虫体内线粒体的裂解与融合。5龄幼虫蜕皮变成蛹，原来昆虫组织和器官被破坏，逐渐形成新的成虫的组织、器官［29］。因此，像线粒体之类的组织和细胞器都会被破坏，各种参与蛹中组织、细胞器构成的蛋白质以及各种调节自身功能的激素、神经递质、细胞因子、酶等都需要囊泡的运输功能，MaARF1可能调控了蛹期各种组织、器官形成所需的囊泡运输。MaARF1在第2天蛹中的表达量达到峰值，可能是此时进行神经系统发育，会有大量的突触囊泡形成用于神经递质传递［30］。在初羽化的成虫中其表达量迅速下降，而后稍有上升，推测MaARF1主要调控松墨天牛蛹期的囊泡运输。MaARF1在初蛹化的第1天蛹中表达量上升，在初羽化的成虫中表达量迅速下降，而后缓慢上升，这表明MaARF1可能主要影响松墨天牛蛹化和羽化这2个变态发育关键点，从而影响整个完全变态发育历程。

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Sequence and Expression Analysis of ADP-ribosylation Factor 1 Gene from Monochamus alternatus

CHEN Jingxiang，CHENG Jie，LIN Tong*
(College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China)

To explore the expression characteristics of ADP-ribosylation factor 1 gene(ARF1)from Ras supergene family in the process of insect development and under temperature stress，ARF1 gene was filtrated from cDNA library of Monochamus alternatus，as the research object，and was named MaARF1 (GenBank:KY368168)，whose sequence and expressional characteristic in each insect state or under different temperature stress were analyzed in this study.The results showed that the coding sequence of MaARF1 was 549 bp in length，encoding 182 amino acids.The predicted secondary structure of MaARF1 was mainly composed of alpha helix and beta sheet，followed by random curl and beta turn.Amino acids sequence multiple alignment analysis of MaARF1 showed the highest homology with Tribolium castaneum (100%)and there were one myristoylation(G2)and five conservative domains(G1box—G5box).By RT-qPCR technology，gene expression analysis showed that MaARF1 expression level was associated with holometabolous development of M.alternatus and it was expressed in each insect state，continuously.The expression level was relatively higher in second and fifth instar larvae，showed a rising trend in larvalpupal stage，a downward trend during eclosion，and reached the maximum amount in the following day ofpupa.MaARF1 under different temperature stress was expressed，low temperature and high temperature would lead to lower expression level，when the temperature was higher or lower，falling of expression level was more significant.Therefore，MaARF1 may mainly affect two key metamorphosis point，nymphosis and eclosion，so as to affect the entire development process in M.alternatus，and it may also be involved in the Ca2+signaling pathways depending on the temperature.

Monochamus alternatus;ADP-ribosylation factor 1;temperature stress;metamorphosis;expression characteristics;RT-qPCR

S763.38

A

1004－3268(2017)07－0057－07

2017－01－01

国家自然科学基金项目(31470653);广东省自然科学基金项目(2015A030313416)

陈敬祥(1993－)，男，湖北荆州人，在读硕士研究生，研究方向:昆虫分子生物学。E－mail:2441430459@qq.com

*通讯作者:林同(1969－)，男，黑龙江通河人，教授，博士，主要从事昆虫分子生物学研究。E－mail:lintong@scau.edu.cn