菠萝皮渣中乳酸菌的分离鉴定及其生长特性研究

香换玲，何艳梅，林峰，冉苒，陈志聪，王玲

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

菠萝皮渣中乳酸菌的分离鉴定及其生长特性研究

香换玲，何艳梅，林峰，冉苒，陈志聪，*王玲

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

从3个不同种植基地来源的菠萝皮中初步分离出10株疑似乳酸菌，经触酶试验、革兰氏染色试验、溶钙圈试验、糖发酵试验、明胶液化试验、吲哚试验、运动性试验等生理生化试验鉴定，证实其中的2株菌B3和C3具备乳酸菌的基本特征，初步鉴定为乳酸菌；对其生长特性进行研究，2株菌的对数生长期均为6～14 h，在22～47℃温度范围内有良好的耐热能性，在pH值2.5～6.5的环境中能良好生长，说明试验分离到的这2株乳酸菌对外界环境有良好的适应能力。

菠萝皮；乳酸菌；分离鉴定；生长特性

0 引言

菠萝是我国南方栽培面积较大、产量较多的大宗水果之一，成熟时色泽鲜艳、营养丰富、味道清甜、气味芳香，深受广大消费者的喜爱[1]。菠萝水分含量高、不耐贮藏，产地收货季节一般都就地加工成菠萝罐头、果酱、蜜饯、果干等产品[2]。在菠萝果实的加工过程中，会产生占全果质量50%～60%的皮渣副产物[3]。这些皮渣中含有大量的糖分、纤维素、半纤维素等碳水化合物及其他适宜微生物生长的营养成分[4]。

目前，国内利用果蔬加工副产物生产青贮饲料的研究比较热门。将菠萝皮渣粉碎后接种乳酸菌，可以生产适合家畜饲养的青贮饲料[5-6]，这种通过乳酸菌发酵生产的青贮饲料，具有改善饲料的发酵品质、增加营养价值、提高畜禽机体抵抗力、节省养殖户饲养成本等特点。但是，所使用的发酵乳酸菌菌种大部分都是购买于一些大型的研究所，对青贮饲料的生产存在专一性不强、生产效率较低等问题。

各种农副产品加工下脚料都有自身的特性。有针对性地从菠萝皮渣中分离乳酸菌，旨在为菠萝皮渣生产青贮饲料提供更为高效专一的菌种，进而提高菠萝皮渣青贮饲料的品质和利用效率。

1 材料与方法

1.1 材料

菠萝，采自湛江雷州3家不同种植园。

1.2 试剂

盐酸、碳酸钙、葡萄糖、过氧化氢酶、吐温80，均为AR级。

MRS固体培养基、MRS肉汤培养基、PY培养基、明胶基础培养基、色氨酸培养基、蛋白胨水培养基、琼脂粉、酵母提取物。

1.3 主要仪器

HPX-9162MB型恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；显微镜，OLYPUS公司产品；PHSJ-4A型pH计，上海精密科学仪器有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 乳酸菌的富集培养[7-15]

将成熟度为九成熟的菠萝全果取下表皮并粉碎，取样25 g置于装有225 mL无菌水的锥形瓶中摇匀稀释至10-1，再依次稀释直至10-5，振荡培养10 min后，分别吸取100 μL上清液转入MRS培养基中，用无菌棒涂布均匀，置于37℃培养箱中培养48 h。待菌落长成后，选择具有乳酸菌典型菌落特征的单个菌落进一步划线分离3次，显微镜观察为纯菌落后移植在MRS斜面上，在37℃条件下培养48 h，于4℃冰箱中保存备用。

1.4.2 乳酸菌的鉴定

（1）过氧化氢酶试验。在载玻片上滴1滴过氧化氢溶液，挑取1环疑似菌株溶于过氧化氢溶液中，观察菌体是否产生气泡。

（2）革兰氏染色试验。对疑似菌进行革兰氏染色，显微镜下观察菌体的个体形状和颜色。

（3）生理生化鉴定。①溶钙圈试验。乳酸菌生长时，乳酸的产生会将菌体周围的钙溶解掉，形成透明圈。在MRS固体培养基中加入2%的碳酸钙制成平板，取1环疑似菌划线接种于其上，在37℃条件下培养48 h，观察培养基中钙的溶解性。②糖发酵试验。在预先放有1支小导管的PY培养基中接种1～2环疑似菌株，摇匀后于37℃条件下培养24 h，观察培养基的颜色和小导管是否浮起。③明胶液化试验。接种1环疑似菌株于明胶培养基中，于37℃条件下培养24 h，观察培养基凝固情况。④吲哚试验。接种1环疑似菌株于色氨酸培养基中，于37℃条件下恒温培养48 h，加入2滴吲哚试剂，观察培养基上层溶液颜色变化。⑤运动性试验。在MRS肉汤培养基中加入0.4%琼脂粉制备半固体培养基，在其中接种1环疑似菌株，在37℃生化恒温箱中培养48 h，观察菌体在半固体培养基的生长情况。

1.4.3 乳酸菌生长特性研究

（1）乳酸菌的生长曲线。将疑似菌株接种于MRS肉汤培养基中，在37℃条件下培养，每隔2 h取样，于波长600 nm处测OD值，观察培养时间与菌株生长的关系，绘制生长曲线。

（2）乳酸菌产酸能力测试。按照上述1.4.3（1）中的培养方法，在37℃的培养条件下，每隔2 h取样测定细菌培养液的pH值，观察疑似菌株的产酸能力。

（3）乳酸菌耐受性试验。乳酸菌耐受性试验包括耐热性、耐酸性试验等。①乳酸菌耐热性试验。将疑似菌接种于MRS肉汤培养基中，分别置于17，22，27，32，37，42℃温度下培养48 h，每株菌每个温度下重复试验3次，设置1个对照，观察菌株的生长情况。②乳酸菌耐酸性试验。用HCl溶液调节MRS肉汤培养基的酸度，使其pH值分别为2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，接种疑似菌株到各酸度梯度的MRS肉汤培养基中，每个株菌在同一酸度条件下重复试验3次，设置1个对照，于37℃条件下培养48 h，观察菌株生长情况。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离

按1.4.1中的方法进行操作，将各稀释度的样品稀释液均匀涂布在MRS固体培养基表面，于37℃恒温箱中培养48 h。菌落长成后，根据乳酸菌的菌落特征及显微镜下的个体形态特征，初步分离到10株疑似乳酸菌。

乳酸菌分离结果见表1。

表1 乳酸菌分离结果

由表1可以看出，菌落颜色大多以白色、乳白色、表面白色、底部淡黄色为主，外形以圆形为主，表面光滑、湿润，质地均匀，容易挑取；显微镜下观察其个体形态有细长杆状或成链、两端钝圆、球状或卵球状，不具运动性，无芽孢。

2.2 乳酸菌的鉴定

2.2.1 过氧化氢酶试验

过氧化氢酶试验是乳酸菌的一个重要鉴定试验。乳酸菌一般不会分泌过氧化氢酶，不能将过氧化氢溶液分解代谢生成水和氧气。根据1.4.2（1）中描述的试验方法及步骤，对挑选出的10株疑似乳酸菌进行过氧化氢酶试验。

疑似乳酸菌的过氧化氢酶试验结果见表2。

表2 疑似乳酸菌的过氧化氢酶试验结果

由表2可以看出，10株疑似乳酸菌与过氧化氢溶液接触后，A1，A2，B1，B2，B4，C1，C2，D1均呈阳性反应，不符合乳酸菌的生理特性；B3和C3呈现阴性反应，符合乳酸菌的生理特性。因此，可以初步判断A1，A2，B1，B2，B4，C1，C2，D1均不是乳酸菌，B3和C3留待后续继续鉴定。

2.2.2 革兰氏染色试验

对B3和C32株疑似菌进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的染色情况和菌体细胞的个体形态，结果B3和C32株菌均为紫色，形态为球状或杆状，成对或成链排列，具备乳酸菌的基本特征。

2.2.3 生理生化鉴定

根据1.4.2（3）生理生化鉴定描述的试验步骤，对B3和C32株疑似乳酸菌菌株分别进行溶钙圈试验、糖发酵试验、明胶液化试验、吲哚试验、运动性试验等。

疑似乳酸菌的生理生化试验结果见表3。

表3 疑似乳酸菌的生理生化试验结果

由表3中可以看出，B3和C3菌株均具备乳酸菌该有的生理生化特性，结合以上试验，基本可以确定为乳酸菌。

2.3 乳酸菌的生长特性

2.3.1 乳酸菌的生长曲线

按照1.4.3（1）中的方法，按5%的接种量将疑似菌株B3和C3分别接种于MRS肉汤培养基中，在37℃条件下培养，每隔2 h取样，于波长600 nm处测OD值，观察培养时间与菌株生长的关系，绘制生长曲线。

乳酸菌的生长曲线见图1。

图1 乳酸菌的生长曲线

从图1可以看出，乳酸菌B3在0～8 h的生长迟缓期内菌体数量增加比较小，曲线缓慢上升；在之后的8～14 h，菌体生成量明显增多，为该菌生长的对数期；14 h后，菌体生成量变化不大，乳酸菌的生长进入了稳定期。乳酸菌C3生长的迟缓期在0～6 h，6～14 h为其生长的对数期，14～20 h为其稳定期。因此，B3和C32菌株均能在MRS肉汤培养基中良好生长，但C3比B3能较早进入对数期，且对数期持续时间较长。

2.3.2 乳酸菌的产酸曲线

根据1.4.3（2）乳酸菌的产酸能力测定方法，测定不同培养时间下B3和C3在培养基中酸度的变化情况。

乳酸菌的产酸曲线见图2。

图2 乳酸菌的产酸曲线

由图2可以看出，乳酸菌B3和C3在前5 h的酸度变化均不明显，培养液处于相对稳定的状态；在5～14 h，pH值明显下降，乳酸菌大量繁殖，培养液中总酸含量增高；14 h后，2株菌的pH值均变化不大，均保持在一个相对稳定的水平；在20 h时，B3和C3的pH值都稳定在3.5左右。由此可见，2株菌都具备较强的产酸能力。

2.3.3 乳酸菌的耐热性

按1.4.3（3）①中描述的方法，将乳酸菌B3和C3接种到MRS肉汤培养基后，放置在17，22，27，32，37，42℃共6个温度梯度下培养48 h，取出观察细菌培养液的浑浊度和试管底部沉淀物，判断其生长情况。

乳酸菌在不同温度下的培养情况结果见表4。

表4 乳酸菌在不同温度下的培养情况结果

由表4可以看出，乳酸菌B3和C3的生长能力受温度的影响比较明显。在17℃的低温条件下，乳酸菌B3和C3不生长；从22℃开始，随着温度的逐渐上升，细菌的生长逐渐变得活跃，菌液浓度不断增大；到42℃时，2株试验菌表现出了最强的生长能力；但在47℃时，菌体的生长量又降低了。说明乳酸菌B3和C3在一定的温度范围内有良好的耐热性。2.3.4乳酸菌的耐酸性

按1.4.3（3）②中描述的方法，将乳酸菌B3和C3分别按8%的接种量接种到pH值2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5的MRS肉汤培养基中，在37℃条件下培养48 h，观察菌液浓度和试管底部的沉淀物，判断细菌的生长情况。

乳酸菌在不同pH值中的培养情况见表5。

表5 乳酸菌在不同pH值中的培养情况

由表5可以看出，乳酸菌B3和C3能在pH值2.5～6.5的环境中生长，说明试验所筛选2株乳酸菌的酸度耐受范围比较广，对外界酸度环境有良好的适应能力。

3 结论

（1）从不同种植基地来源的菠萝果皮中初步分离出10株疑似乳酸菌，经触酶试验、革兰氏染色试验、溶钙圈试验、糖发酵试验、明胶液化试验、吲哚试验、运动性试验等生理生化试验鉴定，证实其中的2株菌B3和C3具备乳酸菌的基本特征，判断为乳酸菌。

（2）乳酸菌B3和C3在MRS肉汤培养基中于37℃条件下能良好生长，其对数生长期均为6～14 h；2株乳酸菌在22～47℃温度范围内有良好的耐热能性；在pH值2.5～6.5的环境中能良好生长，对外界环境有良好的适应能力。

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Study of Isolation，Identification and Growth Characteristics of Lactic Acid Bacteria from Pineapple Peel

XIANG Huanling，HE Yanmei，LIN Feng，RAN Ran，CHEN Zhicong，*WANG Ling
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）

Ten strains of suspected lactic acid bacteria which are initially isolated from pineapple peel that came from three different pineapple planting base.The experiments include catalase test，gram staining，calcium dissolving test，sugar fermentation test，gelatin liquefaction test，indole test，motile test.It is confirmed that the two strains of bacteria（B3and C3）have the basic characteristics of lactic acid bacteria and is judged as lactic acid bacteria though the identification of biochemistry experiments.The research of grow characterization of this two strains of bacteria showed that the logarithmic period is 6～14 h，having good heat tolerance between temperature range from 22～47℃and growing well within pH 2.5～6.5 range.In short，two strains of lactic acid bacteria which are isolated from this experiment have highly adaptability to environment.

pineapple peel；lactic acid bacteria；isolation and identification；grow characterization

TQ914.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.013

1671-9646（2017）06a-0041-04

2017-05-03

广东海洋大学2016年地方高校国家级大学生创新训练项目资助（CXXL2016008）。

香换玲（1995—），女，本科，研究方向为食品质量与安全。

*通讯作者：王玲（1965—），女，硕士，副教授，研究方向为食品加工技术及食品微生物学方面的教学与研究。