前体氨基酸对赤霞珠干红葡萄酒中生物胺含量的影响

张凯婷，王瑞，翟银成，赵宾宾，马雪蕾，张珍珍*

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.昌吉市农产品质量安全检验检测中心，新疆昌吉831100）

前体氨基酸对赤霞珠干红葡萄酒中生物胺含量的影响

张凯婷1，王瑞1，翟银成2，赵宾宾1，马雪蕾1，张珍珍1*

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.昌吉市农产品质量安全检验检测中心，新疆昌吉831100）

以新疆地产赤霞珠果实为原料，在葡萄汁中分别加入不同浓度的7种前体氨基酸，进行酒精发酵与苹果酸-乳酸发酵。通过高效液相色谱法的分析检测，了解前体氨基酸对葡萄酒中8种生物胺含量的影响。结果表明，前体氨基酸对葡萄酒中生物胺的含量产生一定的影响，当加入质量浓度为40 mg/L和100 mg/L的组氨酸时，组胺含量由1.04 mg/L减少为0.20 mg/L和0.35 mg/L；而当加入色氨酸、精氨酸和鸟氨酸时，会使色胺和腐胺的含量有所降低，当加入300 mg/L质量浓度的精氨酸时，腐胺含量由1.45 mg/L减少至0.63 mg/L。当葡萄酒中加入同一种氨基酸时，对葡萄酒中不同的生物胺含量的影响也不尽相同。

葡萄酒；前体氨基酸；生物胺；含量变化

生物胺是普遍存在于发酵食品中的一种含氮有机物，低浓度的生物胺在生物体的正常生理活动中起到一定的作用，但人体若摄入过量的生物胺，则会出现头晕、心悸等症状，严重时还会危及生命[1]。发酵食品中及酒精类食品中常见的生物胺主要有组胺、尸胺、腐胺等单胺，其中组胺和酪胺被认为对人体的危害最大[2]，部分国家也对葡萄酒中的组胺含量做了限量范围：德国≤2 mg/L，比利时5～6 mg/L，瑞士和澳大利亚≤10 mg/L，我国还没有葡萄酒中组胺含量的限量标准[3]。

葡萄酒发酵过程中，微生物中的氨基酸脱羧酶使葡萄汁中的游离氨基酸在脱去羧基产生生物胺，葡萄酒的发酵环境也有助于氨基酸脱羧酶的活动[4-6]。为了解前体氨基酸与葡萄酒中生物胺含量的关系，本实验以新疆地产赤霞珠葡萄为试材酿制葡萄酒，采用高效液相色谱（high performanceliquidchromatography，HPLC）法检测出酒样中组胺、色胺、酪胺、苯乙胺、精胺、亚精胺、尸胺和腐胺等8种生物胺的含量，研究向葡萄汁发酵过程中添加不同剂量前体氨基酸对葡萄酒中生物胺含量的影响，为降低葡萄酒潜在安全隐患，减少葡萄酒中生物胺含量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2016年新疆昌吉地产赤霞珠葡萄（CabernetSauvignon）；组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、赖氨酸（均为分析纯）：加拿大TRC公司；丙酮、甲醇（均为色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；亚精胺、组胺、酪胺、丹磺酰氯、尸胺、腐胺、苯乙胺、色胺、精胺等标准品（均为色谱纯）：美国Sigma公司；氯化钠、乙醚（均为分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；酿酒活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；乳酸菌：山东圣琪生物有限公司。

1.2 仪器与设备

1200 Series高相液相色谱仪（配紫外检测器）：美国Agilent公司；PL303电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；D2155W离心机：德国Sigma公司；HS120210漩涡仪：美国Heathrow Vortexer公司；DHG-9053A恒温箱：上海鸿都电子科技有限公司；CT-6020A pH计：深圳市柯迪达电子有限公司；0.22 μm孔径有机相滤膜：上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄酒酿造工艺流程及操作要点

操作要点：原料经除梗破碎后，在葡萄汁中分别添加组氨酸（组胺前体）0、20 mg/L、40 mg/L和100 mg/L；色氨酸（羟色胺前体）0、15 mg/L、30 mg/L和75 mg/L；苯丙氨酸（苯乙胺前体）0、15mg/L、30mg/L和75mg/L；精氨酸（腐胺、亚精胺和精胺的前体）0、300 mg/L、600 mg/L和1 500 mg/L；酪氨酸（酪胺前体）0、15mg/L、30mg/L和75mg/L；鸟氨酸（腐胺、亚精胺和精胺的前体）0、20 mg/L、40 mg/L和100 mg/L；赖氨酸（尸胺前体）0、10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L，在发酵罐中分别添加酵母菌0.2 g/L、乳酸菌0.015 g/L进行酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵，酒精发酵的温度控制在22～25℃，苹果酸-乳酸发酵的温度控制在18～22℃，苹果酸-乳酸发酵10d后分别取样100mL，新鲜的葡萄酒样置于-40℃冰箱。

1.3.2 生物胺标准系列溶液的配制

分别称量生物胺标准品各10 mg，用0.1 mol/L的盐酸溶液溶解并定容至10 mL，封口后避光保存至4℃冰箱中。分别吸取上述标准溶液各1 mL于同一容量瓶中，同样用0.1 mol/L的盐酸溶液定容至10 mL，即为生物胺标准混合使用液。再量取生物胺标准混合使用液0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL分别置于不同的容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液定容至10 mL，分别使其质量浓度为1.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L，待衍生。

1.3.3 样品提取液的配制

量取葡萄酒样品10 mL，分别向其中加入NaCl至饱和，取饱和后的试样5 mL于15 mL的离心管中，将该溶液的pH调节为12后，加入正丁醇∶氯仿（1∶1，V/V）5 mL进行萃取，3 600 r/min离心10 min后，移取上层清液。再重复2次萃取后，合并萃取液，混匀。吸取3 mL的萃取液，向其中添加1 mol/L的HCl溶液0.3 mL。混匀后在40℃水浴条件下氮气吹干，加入0.1 mol/L的盐酸溶液1 mL溶解，待衍生。

1.3.4 生物胺标准溶液和样品提取液的衍生

分别量取生物胺标准系列溶液0.5 mL于具塞试管中，加入1.5mL的饱和碳酸氢钠溶液和1mL丹磺酰氯衍生溶液，混匀后在60℃条件下避光反应30 min，再向其加入100 μL谷氨酸钠溶液后振荡混匀，60℃条件下反应15 min后，分别加入1 mL的超纯水，40℃水浴条件下用氮吹仪去除丙酮。最后分别加入3 mL乙醚，并漩涡振荡2 min，静置至分层后吸取上层乙醚层，重复萃取2次，合并乙醚萃取液。在40℃的条件下氮气吹干，加入1 mL的甲醇溶液溶解残留物，混匀后直接用0.22 μm有机相滤膜过滤，滤液待HPLC检测。

样品提取液的衍生与生物胺标准溶液衍生条件及方法相同。

1.3.5 高效液相色谱条件

色谱条件：Agilent XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 nm，5 μm），柱温30℃，紫外检测波长254 nm，进样量为20 μL，流动相A：99.99%甲醇溶液，流动相B：超纯水，流速：1.5 mL/min，梯度洗脱程序见表1。

表1 高效液相色谱梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of HPLC

1.3.6 定性定量分析

定性分析：同一色谱条件下，分别比对8种生物胺标准品的HPLC出峰时间，对葡萄酒样品中的各生物胺进行定性分析。

定量分析：通过计算HPLC色谱检测葡萄酒样品中各生物胺的峰面积，依照8种生物胺标准回归方程，计算葡萄酒样品中各生物胺的含量。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度前体酪氨酸对酪胺的影响

酪胺对人类健康有一定影响，其前体氨基酸为酪氨酸[7-9]。由图1可知，不同质量浓度外源酪氨酸的加入对葡萄酒中酪胺含量有一定的影响。在没有外来酪氨酸的加入时，葡萄酒中酪胺的含量为1.39 mg/L，而加入外源酪氨酸质量浓度为15 mg/L时，葡萄酒中酪胺含量显著高于空白对照组（CK）的葡萄酒（P＜0.05），达到了1.94 mg/L，而随着酪氨酸浓度的增加，酪胺的含量先下降后上升。当前体酪氨酸的质量浓度为75mg/L时，葡萄酒中酪胺含量与空白对照组间差异不显著（P＞0.05），但与其他两组葡萄酒中的酪胺含量差异显著（P＜0.05），说明酪氨酸的加入在一定条件下影响了酪胺的生成和积累。

图1 不同质量浓度酪氨酸对酪胺含量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of tyrosine on tyramine contents

2.2 不同质量浓度前体赖氨酸对尸胺的影响

图2 不同质量浓度赖氨酸对尸胺含量的影响Fig.2 Effects of different concentrations of lysine on cadaverine contents

尸胺的氨基酸前体为赖氨酸[10-11]，由图2可知，当加入前体赖氨酸的质量浓度为10 mg/L时，葡萄酒中尸胺含量相较于空白对照组（CK）组有显著差异（P＜0.05），其含量远高于CK组中尸胺的含量。但加入赖氨酸的质量浓度为20 mg/L和50 mg/L时，葡萄酒中尸胺的含量与CK组间差异不显著（P＞0.05），说明前体赖氨酸的加入在一定浓度范围时可以影响葡萄酒中尸胺的含量。

2.3 不同质量浓度前体苯丙氨酸对苯乙胺的影响

由图3可知，在没有苯丙氨酸加入时，葡萄酒中苯乙胺含量为2.01 mg/L，当加入不同浓度外源苯丙氨酸时，苯乙胺含量相对于空白对照组（CK）组均有所增加，且各试验组相互之间存在显著差异（P＜0.05）。当外源苯乙氨酸的质量浓度为15 mg/L和75 mg/L时，葡萄酒中苯乙胺含量明显高于CK组，但当外源苯乙氨酸的质量浓度为30 mg/L时，葡萄酒中苯乙胺含量虽高于CK组，却明显低于其他两组（P＜0.05）。说明外源苯丙氨酸的加入对苯乙胺生成有促进作用，但与外源苯丙氨酸的质量浓度无关。

图3 不同质量浓度苯丙氨酸对苯乙胺含量的影响Fig.3 Effects of different concentrations of phenylalanine on phenethylamine contents

2.4 不同质量浓度前体组氨酸对组胺的影响

图4 不同质量浓度组氨酸对组胺含量的影响Fig.4 Effects of different concentrations of histidine on histamine contents

葡萄酒中组胺对人体危害较大，摄入量超过一定范围时，即会产生中毒症状。其氨基酸前体为组氨酸[12-14]。由图4可知，空白对照组（CK）酒样中组胺含量为1.04 mg/L，当质量浓度为20 mg/L外源组氨酸的加入时，葡萄酒中组胺含量有所增加，达到1.14 mg/L。但当加入的组氨酸质量浓度变为40 mg/L和100 mg/L时，葡萄酒中组胺含量显著减少（P＜0.05），且不高于0.4 mg/L。可以看出，加入质量浓度在40～100 mg/L的外源组氨酸时，对葡萄酒中组胺的生成有一定的抑制作用，不利于组胺在葡萄酒中的合成和积累。

2.5 不同浓度前体色氨酸对羟色胺含量的影响

由图5可知，加入不同质量浓度的色氨酸时，各试验组间差异显著（P＜0.05）。相较于空白对照组（CK）酒样，加入外源色氨酸时，葡萄酒中羟色胺的含量显著下降（P＜0.05）。而随着葡萄酒中色氨酸质量浓度的增加，葡萄酒中羟色胺的含量也有所减少。在CK组酒样中检测到的羟色胺的含量为66.19 mg/L，而当加入色氨酸质量浓度为1 500 mg/L时，羟色胺含量为16.27 mg/L。说明色氨酸的加入与羟色胺的合成有一定的关联。

图5 不同质量浓度色氨酸对羟色胺含量的影响Fig.5 Effects of different concentrations of tryptophan on hydroxytryptamine contents

2.6 不同质量浓度前体精氨酸的加入对生物胺的影响

图6 不同质量浓度精胺酸对腐胺(a)、亚精胺(b)和精胺(c)含量的影响Fig.6 Effects of different concentrations of arginine on putrescine (a),spermidine(b)and spermine(c)contents

葡萄酒中精氨酸同时为腐胺、亚精胺和精胺的前体氨基酸[15]，由图6可知，葡萄酒中加入同种精氨酸时，对葡萄酒中腐胺、亚精胺和精胺均产生不同的影响。其中，相对于空白对照组（CK）组葡萄酒，外来精氨酸的加入使葡萄酒中的腐胺含量减少，使亚精胺和精胺的含量有所增加（P＜0.05）。且随着精氨酸质量浓度的提升，葡萄酒中精胺含量也随之减少。生物胺的合成是一个复杂的过程，在一定范围内，精氨酸的加入有利于亚精胺和精胺积累但同时能够抑制腐胺的生成。

2.7 不同质量浓度前体鸟氨酸的加入对生物胺的影响

图7 不同质量浓度鸟氨酸对腐胺(a)、亚精胺(b)和精胺(c)含量的影响Fig.7 Effects of different concentrations of ornithine on putrescine (a),spermidine(b)and spermine(c)contents

鸟氨酸也为腐胺、精胺、亚精胺共同的前体氨基酸[16]，与精氨酸相同的是，鸟氨酸的加入同样也会使葡萄酒中的腐胺含量有所降低，使葡萄酒中亚精胺和精胺含量上升。但与精氨酸不同的是，加入不同质量浓度鸟氨酸时，各组间葡萄酒中腐胺含量差异不显著（P＞0.05），而精胺和亚精胺则都是在外源鸟氨酸质量浓度为20mg/L时含量最高，且在加入的鸟氨酸质量浓度为40mg/L时有所下降，但均不低于空白对照组（CK）的酒样中精胺和亚精胺的含量。且当外源鸟氨酸的质量浓度为100 mg/L时，这两种生物胺的含量又有所上升。故不同的氨基酸前体的加入对亚精胺、腐胺和精胺的生成都有一定程度的影响作用，但其浓度对其的影响未呈现一定的规律性，影响程度和方式也有所区别。

3 结论

本实验通过向葡萄汁中添加不同浓度的7种氨基酸分别发酵，发酵结束后对葡萄酒中的8种生物胺含量进行检测。结果表明，加入不同浓度的前体氨基酸对葡萄酒中各生物胺含量造成不同程度的影响。其中，加入低质量浓度的酪氨酸、赖氨酸、组胺和苯丙氨酸时，其对应生物胺含量有所上升，但并未随着外源氨基酸质量浓度的升高而增加。当组氨酸质量浓度为40 mg/L和100 mg/L时，葡萄酒中组胺含量则会明显减少，只有0.20 mg/L和0.35 mg/L。而当加入羟色胺和腐胺的前体氨基酸时，会使这两种生物胺的含量有所降低，腐胺尤为明显，当加入质量浓度300 mg/L的精氨酸时，其含量由1.45mg/L减少至0.63mg/L，且在一定质量浓度范围内其含量与外源氨基酸的质量浓度无关。结果表明，当葡萄酒中加入同一种氨基酸时，对葡萄酒中不同的生物胺含量的影响也不尽相同。生物胺是由相应前体物氨基酸在脱缩酶作用下经过脱羧反应转化而来，由此可见葡萄酒中前体氨基酸会影响葡萄酒中各生物胺生成和转化，各生物胺及氨基酸相互间的转化也会影响葡萄酒中生物胺的含量。

[1]蔡成岗，张慧，王智敏，等.食品中生物胺及其检测方法研究进展[J].食品研究与开发，2009，30（10）：153-156.

[2]张敬，赵树欣，薛洁，等.葡萄酒中生物胺含量的影响因素研究[J].中国酿造，2012，31（10）：18-21.

[3]田园，刘蕊，潘秋红.赤霞珠干红葡萄酒发酵过程中氨基酸的转化与利用[J].中国酿造，2012，31（10）：26-28.

[4]黎姗姗，田园，朱保庆，等.龙眼干白葡萄酒发酵过程中生物胺和氨基酸含量的变化[J].中外葡萄与葡萄酒，2011，21（7）：4-8.

[5]芮鸿飞.外源氨基酸对黄酒发酵的影响研究[D].杭州：浙江农林大学，2015.

[6]高年发，李磊，邓旭衡.葡萄酒酿造过程中氨基酸含量变化的研究[J].中国酿造，2011，30（1）：28-32.

[7]HERBERT P,ABRITA M J,RATOLA N,et al.Free amino acids and biogenic amines in wines and musts from the Alentejo region.Evolution of amines during alcoholic fermentation and relationship with variety, sub-region and vintage[J].Food Eng,2004,66(3):315-322.

[8]LONVAUD F A.Biogenic amines in wines:role of lactic acid bacteria [J].FEMS Microbiol Lett,2001,199(11):9-13.

[9]孔维府，范春艳，黄卫东，等.论葡萄酒中生物胺生成的影响因素及检测方法[J].中国酿造，2010，29（6）：13-16.

[10]邓玉杰，马雪蕾，张凯婷，等.新疆不同地区生产的葡萄酒中八种生物胺含量的测定[J].中国酿造，2016，35（7）：171-174.

[11]张春晖，夏双梅，张军翔，等.葡萄酒中的生物胺的生产与工艺控制[J].食品科学，2002，23（10）：128-130.

[12]李志军，吴永宁，薛长湖.生物胺与食品安全[J].食品与发酵工业，2004，30（10）：84-91.

[13]王瑞，陈新军，吴新月，等.新疆赤霞珠葡萄酒发酵过程中生物胺含量的变化[J].中国酿造，2017，36（1）：131-134.

[14]谷凤霞.啤酒中生物胺的检测及形成机制研究[D].大连：大连工业大学，2015.

[15]张凤杰，薛洁，王异静，等.黄酒中生物胺的形成及其影响因素[J].食品与发酵工业，2013，39（2）：62-67.

[16]张无疾，夏小乐，张斌，等.黄酒前酵中生物胺生成规律研究[J].现代食品科技，2015，31（10）：269-300.

Effects of precursor amino acids on biogenic amines contents in Cabernet Sauvignon dryred wine

ZHANG Kaiting1,WANG Rui1,ZHAI Yincheng2,ZHAO Binbin1,MA Xuelei1,ZHANG Zhenzhen1*
(1.College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.Changji City Agricultural Products Quality and Safety Inspection and Testing Center,Changji 831100,China)

Using the fruits of Xinjiang Cabernet Sauvignon as raw material,with different concentrations of seven precursor amino acids addition in grape juice,the alcohol fermentation and malolactic fermentation were performed.The effects of precursor amino acids on the contents of 8 kinds of biogenic amines in wine were tested by HPLC.The results showed that:the precursor amino acid had some effect on biogenic amines content in wine.When 40 mg/L and 100 mg/L histidine was added to the wine,the histamine contents were significantly reduced,from 1.04 mg/L to 0.20 mg/L and 0.35 mg/L,respectively.When tryptophan,arginine and ornithine were added,the content of tryptamine and putrescine in wine decreased.When 300 mg/L arginine was added to wine,the putrescine content reduced from 1.45 mg/L to 0.63 mg/L.When the same amino acid was added to the wine,the effects on each biogenic amine in the wine were different.

wine;precursor amino acid;biogenic amine;content change

N34

0254-5071（2017）07-0148-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.032

2017-04-14

新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目（2015211A024）；大学生创新创业训练计划项目（201610758082，201610758170）

张凯婷（1996-），女，本科生，研究方向为食品质量与安全。

*通讯作者：张珍珍（1984-），女，副教授，博士，研究方向为食品质量与安全。