大方臭豆腐中高产纳豆激酶菌株的分离鉴定

高泽鑫，何腊平，2*，刘亚兵，高冰，李翠芹，刘涵玉

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州贵阳550025；3.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉430068；4.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025）

大方臭豆腐中高产纳豆激酶菌株的分离鉴定

高泽鑫1，何腊平1，2*，刘亚兵1，高冰3，李翠芹4，刘涵玉1

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州贵阳550025；3.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉430068；4.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025）

该实验对从大方臭豆腐中分离纯化得到的8株产纳豆激酶菌株进行了研究，通过纤维蛋白平板法对其产纳豆激酶能力的测试，筛选出一株酶活力达到5 435.39 IU/g的高产纳豆激酶菌株GUYR02。对该菌株的菌株形态、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系统发育树分析，鉴定菌株GUYR02为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

大方豆腐；纳豆激酶；筛选；鉴定；解淀粉芽孢杆菌

纳豆起源于中国的秦汉时期，是传统的发酵食品，唐朝时期传入日本，食用历史已有1 000年以上[1]。纳豆类似中国的发酵豆和豆豉，主要经枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵而来，日本将纳豆作为调味品和营养食品，国人把豆豉用锅蒸后或炒后作为调味料[2]。日本学者SUMI H等[3]于1987年首次对纳豆及其提取物首次作了系统研究，最初将酶的提取物添加到纤维蛋白平板上，发现有明显的溶栓作用，并确定其属于具有纤溶活性的激酶。

人类的健康常年受到血栓疾病的威胁，全球每年因患血栓类疾病死亡的人数多达1 200万，其中中国约占总数的1/5[4]，因此溶栓药物的开发成为了研究的热点。由于纳豆激酶具有高效溶栓作用，因此受到了广泛的关注[5]。纳豆激酶的来源有很多，如日本纳豆食品[6]、一些海洋生物[7]、韩国酱油[8]、台湾的土壤[9]、中国的豆豉[10]和亚洲发酵虾酱等[11]。据报道纳豆激酶可以降低纤维蛋白原、促进催化血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶、增加体内血栓溶解因子的合成的作用[12]。目前，许多研究人员的重点在对高产纳豆激酶菌株的分离筛选、纳豆激酶的纯化和鉴定新发现的纤溶酶[13-15]。本研究从我国传统食品臭豆腐中筛选出一株高产纳豆激酶菌株，并采用菌株形态特征、生理生化实验和16SrDNA测序对菌株进行鉴定，为纳豆激酶的生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

臭豆腐：贵州省大方县市售；黄豆：市售有机黄豆（非转基因）。

1.1.2 试剂

牛凝血酶、牛纤维蛋白原：沈阳拜英生物技术有限公司；尿激酶（1 240 IU/瓶）：中国药品生物制品检定所；溶菌酶：北京索莱宝科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒：天根生化科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

初筛培养基（酪蛋白平板）：5 g/L干酪素，1 g/L葡萄糖，1 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L KH2PO4，0.1 g/L MgSO4，20 g/L琼脂，pH 7.0～7.5，121℃灭菌20 min。

斜面培养基（LB培养基）：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，20g/L琼脂，pH7.0～7.5，121℃灭菌20min。

液体种子培养基：10 g/L葡萄糖，5 g/L酵母提取物，10 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH 7.0～7.5，121℃灭菌20 min。

固态发酵培养基：黄豆清洗干净，加入3倍体积的去离子水浸泡，常温浸泡14～18 h，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-10超净工作台：苏州净化有限公司；LS-B75L立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；101-1ASB电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；DW-86L286立式超低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司；CX21SF1奥林巴斯生物显微镜：上海新苗医疗器械制造有限公司；pHS-3CpH计：成都世纪方舟科技有限公司；SPX生化培养箱：上海科恒实业发展有限公司；HYG-A全温摇瓶柜：太仓市实验设备厂；S1000TM聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Thermal Cycler公司；Gel Doc XR凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司；Micro 17R微量高速冷冻离心机：美国Thermo Electron公司。

1.3 实验方法

1.3.1 产纳豆激酶菌株的分离与初筛

将臭豆腐切碎制成样品悬液用8.5%的生理盐水10倍梯度稀释，取10-7、10-8、10-9三个稀释度涂布于酪蛋白平板上。纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶，可水解酪蛋白平板形成透明圈，根据这一特性在37℃条件下倒置培养24 h后挑取出8株形态不同且有明显透明圈的菌落，在新的酪蛋白平板上进行划线，纯化3代后，接种到斜面培养基上于4℃冰箱保存备用。用接种环挑选2～3环斜面培养基上的菌苔接种到液体种子培养基中，于37℃、180r/min的条件下培养24 h。培养完成后于4℃、10 000×g离心10 min，即得粗酶液。用直径为2 mm的无菌胶头吸管在酪蛋白培养基上均匀打孔，每平板均匀打3孔，取10μL离心后粗酶液注入平板孔（三孔为一组平行），平板放于37℃恒温培养18 h，培养结束后测量平板孔水解透明圈面积（mm2），选取水解透明圈面积最大的3株菌种进行复筛。

1.3.2 原料预处理与固态发酵粗酶液的制备

挑选颗粒饱满、无虫咬、无霉烂、无畸形、色泽淡黄的市售有机黄豆，去离子水冲洗，直至无杂物，豆水质量比1∶3浸泡14～18 h后，分装入三角瓶各25 g放在高压蒸汽灭菌锅中蒸煮20min，随即取出放入无菌操作台内进行冷却。挑取初筛得到的3株菌种2～3环菌苔接种到液体种子培养基中，于37℃、180 r/min的条件下培养18 h，然后按4%的接种量接种到灭菌的固态发酵培养上，在37℃条件下培养36 h，每12 h搅拌一次。称取2 g发酵完成的纳豆溶于4 mL无菌的生理盐水中，4℃条件下浸提24 h，用玻璃棒捣碎经12 000×g离心10 min，再向离心管加入2 mL生理盐水捣碎离心，上清液即为固态发酵粗酶液。

1.3.3 高产纳豆激酶菌株的复筛

（1）纤维蛋白原平板的制作

纳豆激酶活性的测定采用琼脂糖-纤维蛋白原平板法[16]。首先将1%的琼脂糖溶于0.05mol/L的Tris-HCl（pH 7.8）缓冲溶液中，加热至完全溶解后，取出18 mL置于大试管中，待其冷却至55℃左右，迅速倒入2 mL的牛血纤维蛋白原溶液（1.5 mg/100 mL），不断振荡使其完全混合均匀，注入直径9 cm的培养皿中，再迅速加入1 mL牛凝血酶溶液（1 000 U溶于100mL生理盐水），不断晃动平皿使三者混合均匀，静置1h后，用直径为2mm的无菌胶头吸管在平板上均匀打4孔。

（2）尿激酶标准曲线的制作

参照杨明等[17]对琼脂糖-纤维蛋白原平板法测定纳豆激酶活力方法进行的改进。尿激酶标准曲线的制作：将尿激酶标准品分别配制为248 IU/mL、496 IU/mL、744 IU/mL、992 IU/mL和1 240 IU/mL，各取10 μL点样于新配制的纤维蛋白原平板孔中（四孔为一组平行），放置10 min，37℃培养16 h后取出，测定溶解圈的直径，计算各溶解圈面积。以溶解圈的面积（x，mm2）为横坐标，以尿激酶酶活（y，IU/mL）为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线。

（3）纳豆激酶酶活力测定

取纳豆激酶固态发酵粗酶液10 μL点样于纤维蛋白平板上（四孔为一组平行），放置10 min，移入37℃培养箱，保温16 h后取出，用游标卡尺测定溶解圈的直径并计算各溶解圈面积，根据尿激酶标准曲线回归方程计算样品纳豆激酶酶活。

1.3.4 高产纳豆激酶菌株的鉴定

（1）菌种形态鉴定

将复筛得到的纳豆激酶酶活最高的一株菌，在酪蛋白平板上画线，37℃培养24 h，观察单菌落形态，对该菌株进行革兰氏染色，观察菌体形态。

（2）生理生化鉴定

根据第八版《伯杰细菌鉴定手册》[18]对菌株进行生理生化鉴定。将菌株接入细菌微量生化反应管，37℃条件下培养12 h，考察对色氨酸、丙酮酸盐、Kohn明胶、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、密二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖的利用情况。

（3）样品中DNA提取

将复筛得到的纳豆激酶酶活最高菌株接种于液体种子培养基，于37℃、180 r/min的条件下培养18 h。将培养液置于2 mL离心管，10 000×g离心6 min，重复两次收集沉淀，取上述沉淀加入300 μL溶菌酶（质量浓度50 mg/mL），置于37℃水浴1h，后使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。

（4）16S rDNA序列鉴定

扩增使用的上游引物为27F（AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT），下游引物为1492R（TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC）。25 μL聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）体系为模板DNA 2 μL；27F 2.5 μL；1492R 2.5 μL；GoTaqGreen Master Mix（2×）12.5 μL；去离子水5.5 μL。反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，退火温度从65℃降至55℃，每个循环降低0.5℃，退火时间为3 s，72℃延伸1 min，35个循环；恒定退火温度下进行94℃变性1min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min。将PCR产物送上海生工公司测序，登录美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）将所得序列结果与数据库中的已知序列进行相似性比对，采用MEGA 5.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 产纳豆激酶菌株的分离与初筛结果

通过在酪蛋白平板上稀释涂布分离出8株菌落形态不同且具有明显水解酪蛋白能力的菌株，分别编号为GUYR01、GUYR02、GUYR03、GUYR04、GUYR05、GUYR06、GUYR07、GUYR08。

在已经完成菌株分离纯化的基础上，将菌种进行初筛实验，测量透明圈直径计算水解透明圈面积，初筛结果见表1。

表1 产纳豆激酶菌株初筛结果Table 1 Results of preliminary screening of nattokinase-producing strains

由表1可知，8株菌种溶解蛋白能力从高到低依次是：菌株GUYR02、GUYR05、GUYR04、GUYR01、GUYR07、GUYR06、GUYR03、GUYR08。其中菌株GUYR02、GUYR05、GUYR04的水解透明圈面积分别为（198±14.7）mm2、（190±12.6）mm2、（176±17.3）mm2明显高于其他5株菌，所以选取水解透明圈面积最大的这3株菌种进行复筛。

2.2 高产纳豆激酶菌株的复筛结果

2.2.1 尿激酶标准曲线

以溶解圈的面积（x，mm2）为横坐标，以尿激酶酶活（y，IU/mL）为纵坐标作尿激酶标准曲线，结果见图1。

图1 尿激酶标准曲线Fig.1 Standard curve of urokinase

由图1可知，尿激酶标准曲线回归方程为y=4.201 6x－10.874，相关系数为R2为0.999 4。结果表明，二者线性关系良好。

2.2.2 产纳豆激酶活力结果

将酪蛋白平板初筛得到的菌株GUYR02、GUYR05、GUYR04进行纳豆固态发酵，离心取上清液10 μL点样于纤维蛋白平板上，37℃条件下培养16 h后用游标卡尺测量溶解圈直径，得出溶解圈面积并放入尿激酶标准曲线回归方程进行计算，结果如表2所示。

表2 复筛菌株纳豆激酶活力Table 2 Nattokinase activities of secondary screening strains

由表2可知，通过琼脂糖-纤维蛋白原平板法得到的3株纳豆芽孢杆菌的纳豆激酶活力分别为5 435.39 IU/g、4 813.55 IU/g和4 578.26 IU/g。国内外有关筛选产纳豆激酶菌株酶活力的报道多数为100～3 000 IU/g，还有部分较高纳豆激酶酶活力的报道为3000～5000IU/mL[19-23]。另外，夏丽等[24]经过紫外诱变筛选的高产菌株U-5纳豆激酶活力均稳定在5 440.37 IU/mL以上。董艳山等[25]以豆粕粉为氮源优化摇瓶发酵再通过7 L发酵罐使纳豆激酶活性达到6 717 IU/mL。与国内文献报道的酶活比较，本试验所分离筛选菌株GUYR02的纳豆激酶活力高达5 435.39 IU/g，属于高产纳豆激酶菌株。

2.2.3 高产纳豆激酶菌株GUYR02的鉴定

（1）形态鉴定

菌株GYYR02在酪蛋白平板的单菌落形态和革兰氏染色菌体形态见图2。由图2A可知，菌株GUYR02菌落在酪蛋白平板上形成圆形、扁平、有黏性的小菌落，其颜色为乳白色，边缘规则，较湿润，稍隆起，不透明。由图2B可知，该菌株革兰氏染色菌体紫色，为革兰氏阳性菌，杆状。

图2 菌株GUYR02的菌落形态(A)及细胞形态(B)Fig.2 Colonial morphology(A)and cell morphology(B)of strain GUYR02

（2）生理生化鉴定

对筛选出菌株GUYR02进行了部分生理生化特征试验，结果见表3。

表3 菌株GUYR02生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain GUYR02

由表3可知，菌株GUYR02能发酵丙酮酸盐、Kohn明胶、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖，不能发酵色氨酸、肌醇、鼠李糖、蜜二糖、苦杏仁苷和阿拉伯糖。

（3）16S rDNA序列分析及基因系统发育分析

菌株GUYR02PCR产物扩增电泳图见图3，通过MEGA 5.0软件进行系统进化树的构建系统发育树结果见图4。

由图3可知，PCR产物扩增片段送上海生工基因公司测序，测序结果显示菌株GUYR0216SrDNA全长1476bp。

由图4可知，BLAST分析结果显示该基因同解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rDNA基因相似度达到99%。该系统树以莱西式菌（Laceyella tengchongensis）（FJ426598）作为一个单独的外群种，其中GUYR02菌株与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株在同一分支，结合前面的形态学和生理生化鉴定结果，最后鉴定菌株GUYR02为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

图3 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物Fig.3 PCR amplification products identified by agarose gel electrophoresis

图4 菌株GUYR02的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain GUYR02

3 结论

本研究从贵州大方县臭豆腐中分离筛选出一株高产纳豆激酶菌株GUYR02，其在37℃、pH 7.0、培养36 h的固态发酵条件下，其纳豆激酶产量可高达5 435.39 IU/g。通过对该菌株的细胞形态、菌落形态、生理生化特征、16SrDNA序列分析以及系统发育分析，可以鉴定菌株GUYR02为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）。由于菌株GUYR02为野生菌未做培养优化，相对其他工程菌有更大的上升空间。若对其发酵原料和工艺进行优化，提高其产纳豆激酶的发酵性能，这将能明显改善现在国内工程菌生产纳豆激酶的产量不足和产纳豆激酶菌株种类过于单一的研究现状。有利于可持续发展和溶栓药物产业体系的构建，对扩大纳豆激酶产能和解淀粉芽孢杆菌的综合利用范围具有积极意义。

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Screening and identification of strains with high yield nattokinase form Dafang stinky tofu

GAO Zexin1,HE Laping1,2*,LIU Yabing1,GAO Bing3,LI Cuiqin4,LIU Hanyu1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store&Processing of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.College of Bioengineering and Food Science,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;4.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University, Guiyang 550025,China)

Eight nattokinase-producing strains separated from Dafang stinky tofu were investigated in the study.The ability to produce natto kinase of the strains was determined by fibrinogen plate method,and a high yield nattokinase strain GUYR02 with enzyme activity of 5 435.39 IU/g was screened.By morphology,physiological and biochemical characteristics,16S rDNA sequence and phylogenetic tree analysis,the strain GUYR02 was identified asBacillus amyloliquefaciens.

Dafang stinky tofu;nattokinase;screening;identification;Bacillus amyloliquefaciens

Q939.97

0254-5071（2017）07-0058-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.013

2017-05-01

贵州省重大专项（黔科合重大专项字[2015]6004-5号）；贵州省农业攻关项目（黔科合支撑[2016]2580号）

高泽鑫（1993-），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物。

*通讯作者：何腊平（1972-），男，教授，博士，研究方向为发酵工程、生物催化与生物转化。