秦艽不同加工品中有效成分含量与色度的相关性

王秀芬，冷晓红，李 静，陈海燕，郭鸿雁

(1.宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021； 2.宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心，宁夏 银川 750021)

秦艽不同加工品中有效成分含量与色度的相关性

王秀芬1，冷晓红2，李 静1，陈海燕1，郭鸿雁1

(1.宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750021； 2.宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心，宁夏 银川 750021)

采用直接阴干、自然晒干、发汗干燥、80 ℃鼓风干燥等4种不同干燥方法对秦艽进行加工处理，采用HPLC法对秦艽中裂环烯醚萜苷类成分进行含量测定，比较不同加工方法对秦艽质量的影响；采用L*、a*、b*颜色特征参数描述“发汗”前后秦艽颜色，并对秦艽色度变化与成分含量变化进行考察。研究表明，不同加工方法的秦艽药材中裂环烯醚萜苷类成分含量存在一定差异；“发汗”与“未发汗”秦艽色度与成分含量存在相关性。通过探讨不同加工方法对秦艽药材主要化学成分的影响，并对“发汗”前后秦艽的颜色变化进行数值描述，探讨秦艽色度变化与成分含量的相关性。

秦艽； 加工方法； 裂环烯醚萜苷类成分； 色度

秦艽为龙胆科植物秦艽的干燥根，包括秦艽(GentianamacrophyllaPall.)、粗茎秦艽(GentianacrasicaulisDuthie ex Burk.)、麻花秦艽(GentianatramineaMaxim.)及小秦艽(GentianadahuricaFisch.)，具有活血化瘀，祛风除湿，利尿清热功效，临床上多用于治疗风湿病、小儿疳热以及便血等[1]。秦艽的主要活性成分为裂环烯醚萜苷类化合物，其中龙胆苦苷和马钱酸苷含量较高，其他獐牙菜苦苷、獐牙菜苷以及6’-O-β-D-葡萄糖龙胆苦苷均具有良好的药理活性[2-6]。“发汗”是一种常见的中药材产地初加工技术，其目的既有利于药材的干燥，即药材密闭堆积后发热，其内部水分外溢；又可在“发汗”过程中使药材中的某些化学成分发生一些变化，药材或变色，或增加香气，减少刺激性[7-12]。2015年版《中国药典》规定秦艽可发汗处理，发汗后表面呈红黄色或灰黄色。但目前在秦艽的产地加工中，不少产地采用不经发汗，直接干燥的方法。目前对秦艽的产地加工方法研究报道较少。本试验以宁夏地产秦艽为研究样本，采用HPLC法对不同加工方法秦艽中裂环烯醚萜苷类成分进行含量测定，比较不同加工方法对秦艽质量的影响；采用色差仪对发汗与未发汗秦艽测量颜色特征参数，对药材的颜色差异进行数值化研究；并对秦艽色度变化与成分含量变化进行考察，为秦艽的产地加工提供科学评价依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验材料为龙胆科植物秦艽的干燥根，2015年10月采自宁夏六盘山隆德西北药材公司秦艽种植基地。经宁夏药检所鉴定为秦艽的干燥根。

1.2 仪器试剂

高效液相色谱仪Agilent1220、Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦公司)，自动进样器，DAD紫外检测器；电子析天平(十万分之一，Mettler Toledo仪器(上海)有限公司)；GZX-9030MBE型恒温鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)；CS-10精密色差仪(邦亿精密量仪(上海)有限公司)；扁形称量瓶等。

5种对照品分别为马钱酸苷对照品(批号111865-201403)、龙胆苦苷对照品(批号110770-201515)、獐牙菜苦苷对照品(批号110785-201404)(中国食品药品检定研究院)、獐牙菜苷对照品(批号150401 HPLC≥98%)、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷对照品(批号141122 HPLC≥98%)(成都菲德生物技术有限公司)；色谱纯乙腈(天津市科密欧化学试剂开发中心)；试验用水为重蒸水；其余试剂为分析纯。

1.3 不同加工方式秦艽样品的制备

将鲜秦艽药材根部除去泥沙，平均分为4份，分别按下述方法进行加工处理，备用。

直接阴干品。将秦艽新鲜药材放于阴凉通风处，摊开阴干。

自然晒干品。将秦艽新鲜药材放于通风处，摊开太阳弱光下直接晒干。

直接堆置发汗品。将秦艽新鲜药材放于通风处，摊开太阳弱光下晒2～3 d，晒软，堆置，上部和四周用麻袋或塑料薄膜覆盖，堆置“发汗”、至表面呈红黄色或棕黄色时，摊开晒干。

80 ℃干燥品。将秦艽新鲜药材平摊于烘盘内，采用电热鼓风干燥箱80 ℃烘干。

1.4 裂环烯醚萜苷类成分的测定方法及验证

秦艽的主要活性成分为裂环烯醚萜苷类化合物，2015年版《中国药典》将龙胆苦苷和马钱苷酸这2个化合物作为药材质量评价的指标性成分。现代药理学研究结果显示，除龙胆苦苷和马钱苷酸外，其他多种环烯醚萜苷成分均具有良好的药理活性。獐牙菜苦苷、獐牙菜苷及6’-O-β-D-葡萄糖龙胆苦苷均对f MLP诱导产生的超氧化物的生成有抑制作用[13]。依此，本研究确定以马钱酸苷、龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖龙胆苦苷5种活性成分的质量分数作为秦艽质量评价的指标。

1.4.1 色谱条件

ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为0.05%磷酸，流动相B为乙腈，洗脱梯度为0～13 min (91∶9～91∶9)，13～18 min (91∶9～89∶11)，18～23 min (89∶11～80∶20)，23～28 min (80∶20～74∶26)，28～40 min (74∶26～85∶15)；检测波长240 nm；流速0.8 mL·min-1；进样量20 μL，柱温30 ℃；记录色谱图。

1.4.2 对照品溶液的制备

取马钱酸苷、龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含马钱酸苷0.309 4 mg、龙胆苦苷1.144 8 mg、獐牙菜苦苷0.226 8 mg、獐牙菜苷0.028 mg、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷0.160 2 mg的混合对照品溶液，即得。

1.4.3 供试品溶液的制备

取本品粉末(过4号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 kHZ)30 min，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.4.4 线性关系的考察

分别精密称取马钱苷酸、獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含马钱苷酸2.21 mg，獐牙菜苦苷1.89 mg的混合对照品溶液，精密量取混合对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.5 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用；精密称取龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含龙胆苦苷3.62 mg，精密量取龙胆苦苷对照品溶液1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL至5 mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用；精密称取6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷0.89 mg，精密量取6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.5、2.2 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用；精密称取獐牙菜苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含獐牙菜苷1.75 mg，精密量取獐牙菜苷对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用，按上述色谱条件进行测定，以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，见表1。

表1 线性关系考察

1.4.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定对照品色谱峰面积，所得马钱酸苷、龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.79%、1.59%，1.82%、1.85%、1.92%，表明仪器精密度良好。

1.4.6 重复性试验

精密称取同一供试品粉末，按1.4.3方法平行制备供试品溶液6份，测定各成分含量，得到马钱酸苷、龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷的RSD分别为2.09%、1.59%、2.05%、2.01%和2.17%。

1.4.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，按样品含量测定方法，分别在0、2、4、6、8 h进样测定5种成分的峰面积，马钱酸苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷峰面积的RSD分别为2.16%、2.23%、2.08%、2.57%、1.38%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

1.4.8 加样回收率

取已知质量分数的秦艽样品粉末6份，约0.5 g，精密称定，分别按已知质量分数的50%加入马钱酸苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷对照品，按1.4.3方法制备样品，依1.4.1项下色谱条件进样，每次进样量为10 μL，测定5种化学成分的质量分数，计算各成分平均回收率依次分别为98.2%、99.6%、99.4%、97.2%和100.2%，RSD分别为2.8%、2.1%、2.2%、3.1%和1.8%。

1.5 色泽测定方法

中药材在颜色方面的性状特征常常是评价中药材质量的重要依据[14]，目前对这些性状特征的评价主要是依据经验主观描述。本试验采用色差仪对秦艽“发汗”所产生的性状变化进行数值描述，将有助于科学化评价中药材质量。

以色差仪对“发汗”秦艽与未“发汗”秦艽样品的颜色进行测定，分析记录样品的参数L*、a*和b*值，每个样品测定2次，以平均值计。色差仪测定条件：照明光源D65，狭缝宽度1 nm，视场选择10°角，波长扫描范围380～780 nm。

2 结果与分析

2.1 样品的含量测定

取不同加工方式秦艽样品粉末，平行2份，按1.4.3项下条件制备样品溶液，依1.4.1项下色谱条件进样，每次进样量为10 μL，进行裂环烯醚萜苷类成分含量测定。

表2结果表明，在秦艽不同的加工方法中，以80 ℃干燥，主要药效成分龙胆苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷的含量较高。

表2 秦艽不同加工样品裂环烯醚萜苷类成分含量

2.2 色度

2.2.1 色度测定

应用色差仪按1.5项下色泽测定方法测定不同样品色度参数值，结果见表3。采用SPSS19.0统计软件对试验数据进行分析。

表3 秦艽各样品色度参数值

对试验数据进行卡方检验分析，χ2值为69.360，P值为0，表明发汗和未发汗秦艽在颜色上存在差异，且在数值上体现为L*、a*、b*值的显著性差异。

2.2.2 判别分析

由组均值均等性检验结果可知，L*、a*、b*值3个自变量P值均为0，表明在秦艽发汗和未发汗的颜色特征参数L*、a*、b*均有统计学意义。其中，L*、a*、b*的λ值分别为0.020、0.077和0.014。根据λ值越接近0，组间判别越显著这一原则，可知L*、b*的判别更有意义。

综上，L*、b*参数值在发汗秦艽与未发汗秦艽样品上存在差异，说明明度和黄蓝色度是评价秦艽样品颜色的主要指标。

2.3 色度变化与成分含量变化的相关性

将鲜秦艽药材根部除去泥沙，平均分为9份，其中1～3号样品采用自然干燥，4～6号样品晒干表皮采用“发汗”干燥，7～9号样品采用80 ℃鼓风干燥。

2.3.1 样品含量和色度

取上述不同加工方式秦艽样品粉末，进行裂环烯醚萜苷类成分含量测定和色度测定，结果见表4。

表4 秦艽不同加工样品裂环烯醚萜苷类成分含量及色度测定

秦艽药材采用3种干燥方式，其中以80 ℃鼓风干燥药材L*值最大，a*、b*最小，色泽明亮，偏红、偏黄程度较小，颜色最浅，呈淡黄色；“发汗”干燥药材L*值最小，a*、b*最大，色泽发暗，偏红、偏黄程度较大，色泽最深，呈棕黄色；自然干燥药材色泽介于两者之间。从表4可知，秦艽采用“发汗”干燥，獐牙菜苷和獐牙菜苦苷含量明显降低，6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷含量升高。

2.3.2 相关性

采用SPSS 19.0软件对不同加工方式的秦艽药材色度值与裂环烯醚萜苷含量(以龙胆苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷之和计)之间分别进行Pearson相关性分析，结果见表5。

表5 秦艽不同加工样品裂环烯醚萜苷类含量与 色度值相关性分析

注：1)为0.8～1.0极强相关；2)为0.6～0.8强相关。

由表5可知，不同干燥方式秦艽药材裂环烯醚萜苷类成分含量与药材色度均呈极强或强相关，其中药材色度a*、b*值均与含量呈负相关，L*值与含量呈正相关。

3 讨论

发汗是药材加工的重要环节，可促使其中水分发散，化学成分在相关活性酶作用下转化，提高药材品质[15]。本试验显示，秦艽采用阴干、自然干燥、发汗干燥、80 ℃鼓风干燥4种干燥方式，其中以80 ℃鼓风干燥下的主要药效成分龙胆苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的含量较高，堆置发汗干燥6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷的含量明显增加；80 ℃鼓风干燥方式干燥药材中，马钱苷酸的含量低于堆置发汗干燥方式，但明显高于阴干和自然干燥方式。因秦艽药材须根较多，干燥过程中若不采用发汗干燥，须根易断碎，严重影响药材品质，所以在产地加工中可考虑采用80 ℃鼓风干燥和堆置发汗干燥方式相结合进行药材干燥，这样既可缩短干燥时间，又可保证药材品质。两种方法结合加工药材疗效是否更好，有待结合药理与临床研究进一步确定。

通过色差分析仪测定发汗与未发汗秦艽的颜色变化，秦艽发汗后颜色明显加深。通过对发汗与未发汗秦艽色度变化与成分含量变化的考察，随着秦艽药材颜色加深，L*值减小，a*、b*值增大，裂环烯醚萜苷类成分含量逐渐降低，可能是由于发汗过程中相关酶的活性被激活，从而造成药材中环烯醚萜苷类成分被水解，生成半缩醛结构的苷元，进一步聚合而产生棕黑色沉淀，使药材颜色加深。采用80 ℃鼓风干燥直接将酶杀灭，从而抑制裂环烯醚萜苷类成分水解。因此，80 ℃鼓风干燥药材颜色最浅，L*值增大，a*、b*值减小，而裂环烯醚萜苷类成分含量却最高。发汗对药材药效活性影响的研究还很少，难以从药效上来评价发汗这一产地加工的合理性及科学性。

[1] 芦启琴，娄灯吉，沈建伟，等.秦艽化学成分及药理作用研究进展[J]. 安徽农业科学，2007，35(29)：9299-9301.

[2] 李茂星，贾正平，张汝学，等. 秦艽中裂环烯醚萜苷类成分的分离纯化研究[J]. 中成药，2005，27(12)：1384-1386.

[3] 陈千良，石张燕，涂光忠，等. 陕西产秦艽的化学成分研究[J]. 中国中药杂志，2005，30(19)：1519-1522.

[4] 陈长勋，刘占文，孙峥嵘，等. 龙胆苦苷抗炎药理作用研究[J]. 中草药，2003，34(9)：33-36.

[5] 高兰月，高亦珑，赵淑红. 秦艽对心血管的作用及毒性研究[J]. 中国民族民间医药杂志，2010，19(11)：24.

[6] 李艳秋，赵德化，潘伯荣，等. 龙胆苦甙抗鼠肝损伤的作用[J]. 第四军医大学学报，2001，22(18)：1645-1649.

[7] 王初. 发汗与不发汗续断中水溶性浸出物和川续断皂苷VI的比较[J]. 中草药，2007，38(6)：865-866.

[8] 王建华，谢丽华，刘洪宇，等. 玄参不同加工品中哈巴俄苷与肉桂酸的HPLC测定[J].中国药学杂志，2000，35(6)：375-378.

[9] 袁瑶，季龙宝. 传统“发汗”法对丹参中丹参酮IIa的影响[J]. 基层中药杂志，2002，16(3)：29.

[10] 唐晓清，余伯阳，王康才，等. 丹参采收后不同干燥法对丹参酮IIA和丹参素的影响[J]. 中草药，2005，36(增刊)：254.

[11] 杨中林，刘双跃，秦民坚. 不同加工方法对续断中AkebiaSaponin D含量变化的影响[J]. 中医药信息，2000，17(1)：16.

[12] 白云娥，袁鹏飞，王庆辉，等. HPLC-UV波长转换法测定玄参药材及饮片中哈巴苷与哈巴俄苷的含量[J]. 中国中药杂志，2011，36(19)：2697.

[13] 吴靳荣，吴立宏，赵志礼，等.中药秦艽和习用品中5种环烯醚萜类成分的HPLC含量测定[J]. 中国中药杂志，2014，39(4)：715-720.

[14] 刘红亮，晏仁义，郭健，等. 厚朴“发汗”前后药材颜色及气味差异的数值化研究[J]. 中国中药杂志，2013，38(1)：45-47.

[15] 段金廒，宿树兰，严辉. 药材初加工“发汗”过程及其酶促反应与化学转化机制探讨[J]. 中草药，2013，44(10)：1219-1225.

(责任编辑：张瑞麟)

2017-01-04

宁夏科技惠民项目(2015KJHM25)

王秀芬，女，副主任药师，从事中药材质量评价研究工作，E-mail：nxnxwxf@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170623

S567

A

0528-9017(2017)06-0976-05

文献著录格式：王秀芬，冷晓红，李静，等. 秦艽不同加工品中有效成分含量与色度的相关性[J].浙江农业科学，2017，58(6)：976-980.