生长分化因子9在哺乳动物生殖中的作用

王建英+刘昭华+曹顶国+王金文+崔绪奎+张果平

摘要：生长分化因子9（growth differentiation factor 9， GDF9）对哺乳动物生殖活动的调控至关重要。作为转化生长因子β（transforming growth factor beta， TGFβ）超家族成员之一，GDF9主要在卵巢的卵母细胞中表达。除通过经典的GDF9/Smads信号转导通路实施生物学应答外，GDF9还能以不依赖Smads的方式实现其生理作用。GDF9在卵泡发育、卵母细胞发育、排卵、黄体形成、精子发生、受精和胚胎发育等生物学过程中都发挥重要作用。本文对GDF9基因表达、蛋白结构、参与的信号通路及其在哺乳动物生殖过程中可能的生物学功能进行总结及探讨。

关键词：生长分化因子9；哺乳动物；生殖

中图分类号：S814.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）07-0167-06

Abstract Growth differentiation factor 9 （GDF9） is essential for the regulation of mammalian reproduction. As a member of transforming growth factor beta （TGFβ） family， GDF9 is mainly expressed in ovarian oocytes. In addition to the classical GDF9/Smads signal transduction pathway to implement biological response， GDF9 can also achieve its physiological role by independent of Smads. GDF9 plays important roles in follicle and oocyte development， ovulation， corpus luteum formation， spermatogenesis， fertilization， embryo development and so on. In this paper， the gene expression， protein structure， signaling pathway of GDF9 and its possible biological functions in the process of mammalian reproduction were summarized and discussed.

Keywords Growth differentiation factor 9； Mammal； Reproduction

作為转化生长因子β （transforming growth factor beta， TGFβ）超家族成员之一，生长分化因子9（growth differentiation factor 9， GDF9）与哺乳动物生殖活动密切相关，广泛参与卵泡发育[1]、卵母细胞发育、排卵、黄体形成、精子发生、受精和胚胎发育等生物学过程。因此，对GDF9的研究工作有利于揭示哺乳动物繁殖机理、促进生殖健康和利用分子标记辅助选择快速提高动物的繁殖性能和生产效益。为了更好地理解GDF9与哺乳动物生殖之间的关系，促进生殖健康和提高动物繁殖力，本文就GDF9在哺乳动物生殖过程中的作用及对生殖过程的调控等方面的研究进行回顾和总结，以便于GDF9在动物生殖方面的开发和利用。

1 GDF9基因表达、蛋白结构及其参与的信号通路

GDF9基因在进化上比较保守，不同物种间的GDF9存在较高的同源性。物种间差异可能影响GDF9在人类和各种动物体内表达的时间与定位。研究发现，绵羊、牛、负鼠、仓鼠的GDF9表达从原始卵泡阶段开始，而小鼠、大鼠和人的GDF9表达则从初级卵泡阶段开始[2]。GDF9主要在卵巢的卵母细胞中表达[3]，此外，在哺乳动物睾丸[4-6]、垂体、子宫、骨髓[7]中亦有GDF9表达。与大多数TGFβ超家族生长因子不同，GDF9的羧基末端（C-末端）以6个半胱氨酸（Cys）取代了TGFβ超家族保守的7个或9个Cys，而且C-末端参与成熟蛋白二硫键形成的Cys也被丝氨酸（Ser）替换，这表明GDF9单体可能通过非共价健连接形成二聚体[8]。

GDF9通过与单次跨膜的丝/苏氨酸激酶活性受体Ⅰ（activin receptor-like kinase 5， ALK5）、受体Ⅱ（BMP type Ⅱ receptor， BMPRⅡ）高亲和性结合，启动经典的Smad2/3信号通路[9]，调控细胞内特定基因的转录及蛋白的合成，从而影响细胞的功能活动。除通过GDF9/Smads信号转导通路实施生物学应答外，GDF9还能以不依赖Smads的方式调节细胞功能[10]。

从已有的研究结果来看，GDF9广泛参与哺乳动物生殖过程，主要包括卵泡发育、卵母细胞发育、排卵、黄体形成、精子发生、受精和胚胎发育等。

2 GDF9对卵泡发育的作用

下丘脑-垂体-性腺轴间的内分泌调节在卵泡发育过程中发挥重要作用。此外，GDF9在卵泡的生长分化、颗粒细胞的增殖和分化、卵丘扩张、卵泡膜细胞分化、卵巢甾体激素、蛋白酶和细胞因子的合成等过程中亦不可或缺，从而维持稳定的发育卵泡内微环境。由于卵泡生成的初级卵泡阶段受阻，敲除GDF9的小鼠是雌性不育的[11]。体内给予GDF9重组蛋白能促进大鼠的原始卵泡和初级卵泡转变为次级卵泡[12]。

2.1 GDF9调节卵泡的生长和分化

卵泡发育过程可分为促性腺激素不依赖和促性腺激素依赖两个阶段。前者包括原始卵泡和初级卵泡阶段，在此阶段，GDF9通过自分泌或旁分泌的方式来维持卵泡的正常生长和卵母细胞的发育，生殖激素在该阶段不起作用。GDF9可能通过抑制caspase-3的促凋亡作用促进原始卵泡和初级卵泡发育到次级卵泡[13，14]。后一阶段主要由下丘脑-垂体-性腺轴调节卵泡的发育，GDF9可与促性腺激素一起影响优势卵泡的选择以及闭锁卵泡的形成，促进黄体的形成[12，15，16]。GDF9对卵泡发育的影响主要表现在对颗粒细胞、卵泡膜细胞及卵丘的作用上。

目前关于GDF9是否影响原始卵泡向初级卵泡发育存在争议[12，17，18]。体内给与GDF9重组蛋白能促进大鼠从原始卵泡和初级卵泡发育到次级卵泡[12]。在山羊卵巢皮质体外培养过程中，外源添加GDF9也能促使山羊原始卵泡发育到次级卵泡[17]。而Nilsson等则持相反意见，认为GDF9只能促进初级卵泡的发育，而对原始卵泡无影响[18]。这可能是物种差异、研究人员和方法不同所致。

2.2 GDF9影响颗粒细胞的增殖和凋亡，改变其分化状态

GDF9敲除小鼠的初级卵泡的颗粒细胞不能增殖和凋亡[19]。GDF9对未分化颗粒细胞的作用在于降低促卵泡素（follicle-stimulating hormone， FSH）的生物学效应、促进颗粒细胞的增殖和抑制颗粒细胞过早黄素化。GDF9对FSH诱导的孕酮、雌激素和促黄体生成素（luteinizing hormone， LH）受体生成起抑制作用。FSH通过合成环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）促进类固醇生成和LH受体含量增加来介导颗粒细胞分化，GDF9可显著降低FSH诱导的cAMP生成量[20]。同时，GDF9降低颗粒细胞8-Br-cAMP诱导的孕激素合成，降低类固醇激素调节蛋白（StAR）的表达，抑制P450侧链裂解酶、P450芳香化酶的活性和卵泡膜细胞孕酮、17-α羟孕酮及脱氢表雄酮的合成，抑制颗粒细胞分化[21]。在大鼠[22]和人[1]颗粒细胞中，GDF9可刺激抑制素的产生，诱导Smad2的活化，在FSH分泌的反馈调节中起重要作用。

与未分化颗粒细胞不同，GDF9通过前列腺素E2配基受体信号通路使排卵前被FSH/LH激活的颗粒细胞的分化状态发生改变，促进颗粒细胞中前列腺素和孕酮的合成[23]。

GDF9还可通过促进细胞代谢基因和编码糖酵解酶[24]基因表达促进卵母细胞发育，调节颗粒细胞代谢与卵泡发育保持一致[25]。

2.3 GDF9参与卵泡膜细胞的募集和分化

GDF9可影响卵泡膜细胞[21]和膜间质细胞[26，27]类固醇的生物合成，参与卵泡膜细胞募集和分化。GDF9基因敲除小鼠的卵泡膜细胞分化受阻，卵泡膜细胞分化的标志缺乏，如17α-羟化酶（CYP17）、LH受体和C-kit受体[19]。而外源给予GDF9之后，免疫印迹结果表明卵巢匀浆中CYP17的含量增加[12]。

2.4 GDF9可诱导卵丘扩张和分化

排卵前，富含透明质酸的胞外间质在卵丘细胞迅速积累，并引起细胞群扩展。这一过程对于排卵及受精过程极其重要[28]。在出现LH峰时，GDF9导致卵丘和卵母细胞发生下列变化：透明质酸合成酶2 （hyaluronan synthase 2， HAS2）和环氧合酶2（COX2）的表达增加，透明质酸、前列腺素E2（PGE2）和PGE2受体亚型EP2的合成能力增强，StAR的表达量提高，从而促进卵丘扩张、孕酮合成[23]以及卵丘细胞合成胆固醇[29]。

在卵丘卵母细胞复合物（cumulus oocyte complexes， COCs）中，GDF9通过促进HAS2表达和抑制尿激酶（urokinase plasminogen activator， uPA）的表达来启动卵丘扩展[31]。重组的GDF9能上调中国仓鼠颗粒细胞HAS2、COX2和StAR mRNA的表达，下调uPA及LH受体 mRNA的合成，促进富含透明质酸的细胞外基质的形成以维持卵母细胞生长最适宜的内环境[30]。小鼠卵母细胞的HAS2和前列腺素合酶2（Prostaglandin synthase 2， PTGS2） mRNA 水平在注射GDF9 dsRNA 8小时后也明显下降[31]。而Varnosfaderani等则认为在促进绵羊卵丘细胞扩张上，GDF9不起主要作用[32]。

GDF9基因还可以与FSH、BMP15等其他激素或生长因子对动物卵泡发育起协同效应。

3 GDF9对卵母细胞发育的作用

3.1 GDF9可能参与卵母细胞减数分裂的启动和调控

研究发现，绵羊卵巢中GDF9的基因转录从母羊妊娠后56天开始，在94天达最高水平，之后逐步降低。而母羊卵巢上的卵原细胞在妊娠56～75天时开始形成初级卵母细胞[33]。在绵羊卵母细胞的发育过程中，GDF9的最高表达量出现在GV期，其后MⅡ期卵母细胞、2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期和桑椹胚中GDF9的表达量依次下降，囊胚中甚至检测不到其表达[4]。GDF9的表达时间和方式暗示其可能参与绵羊卵母细胞减数分裂的启动和调控[34]。马绒毛膜促性腺激素（eCG）和绒毛膜促性腺激素（hCG）处理GDF9单敲除（+/-）和BMP15双敲除（-/-）双重突变（double mutant， DM）小鼠发现，卵母细胞恢复减数分裂的时间延迟[16]。

3.2 GDF9 影响卵母细胞的生长发育和成熟

卵泡发育和卵母细胞的生长成熟是同步的。GDF9可通过调节卵泡发育、卵丘扩张中关键酶的活性和颗粒细胞形态、数量、排列的变化[30]、维持卵母细胞和体细胞间的通讯（缝隙连接和粘着连接）[35]来影响卵母细胞的生长发育和成熟。GDF9还可激活成熟促进因子MPF和MAPK来调控猪卵母细胞的成熟[36]。GDF9敲除可上调小鼠卵泡中颗粒细胞kit配体和抑制素-α的表达，间接影响卵母细胞的生长和成熟[19]。而外源添加GDF9能够提高牛[37]和猪[38]的卵母细胞成熟率。

FSH诱导GDF9+/-和BMP15-/-DM小鼠体外成熟卵母细胞的卵丘扩张指数显著低于BMP15+/-组、BMP15-/-组或GDF9+/-组。GDF9+/-和BMP15-/-DM小鼠卵丘细胞HAS2表达水平显著低于BMP15+/-组或GDF9+/-组，与BMP15-/-组差别不大，而GDF9+/-和BMP15+/-組的卵丘细胞HAS2表达水平没有差异[16]。

GDF9敲除不会影响小鼠卵母细胞的细胞核成熟，但是会影响卵母细胞的细胞质成熟[16]。GDF9敲除小鼠的卵母细胞的跨透明带突起物（transzonal projection， TZP）倒向卵母细胞，数量减少，结构杂乱无章。体细胞和透明带的联系不很紧密，透明带与卵黄膜的粘附明显减少，颗粒细胞间的相互作用增强。超微结构显示GDF9敲除会导致皮质颗粒和高尔基复合体的片层减少，说明卵原细胞形成成熟卵母细胞的过程受到抑制[35]。

4 排卵和黄体形成

GDF9在排卵和黄体形成过程中亦发挥极其重要的作用。

4.1 GDF9可增加排卵率

钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin， KLH）-GDF9多肽弗氏佐剂免疫会导致排卵的绵羊数量减少，黄体形成受到抑制，未排卵的绵羊伴随正常卵泡发育的抑制和乏情[39]。绵羊的排卵率或产羔数与GDF9基因多态性有关[40]。研究发现，绵羊GDF9基因上有3个位点（Fec GH、Fec TT、Fec GV）的突变杂合子排卵率比野生型要高，而这些突变纯合子是不育的，可能是改变了GDF9成熟蛋白的形成[41]、GDF9形成二聚体的能力[42]以及GDF9与ALK5[43，44]、BMPRⅡ[45]的结合。

4.2 GDF9促进黄体生成

GDF9通过影响优势卵泡的选择以及闭锁卵泡的形成促进黄体生成。在黄体组织中发现BMP受体基因以及GDF9基因和蛋白的表达，也暗示GDF9在黄体形成过程中发挥作用[46]。此外，GDF9可增加抑制素B的表达，抑制素B与活化素（activin）A进行竞争，导致activin A对StAR表达和孕酮生成的抑制作用减弱[47]，亦能对黄体形成产生影响。

5 GDF9在雄性生殖中的作用

已有研究结果表明，GDF9可能在精子发生中发挥作用。成年羊驼生精上皮圆形精子和粗线期精子细胞的胞质中有GDF9表达，GDF9通过作用于生殖细胞或体细胞（如睾丸间质细胞、支持细胞）调控睾丸中精子的发生过程[5]。荷斯坦公牛鲜精和冻精中GDF9基因两个位点的突变与顶体完整率和精子密度显著相关[48]。

睾丸支持细胞（sertoli cell， SC）间紧密连接的动态变化对于血睾屏障（blood testis barrier， BTB）的完整性及精子发生过程至关重要[49]。GDF9可通过影响紧密连接和抑制素的生成影响精子生成，还可通过抑制紧密连接蛋白claudin-11、occludin和zonula occludens-1的膜定位破坏SC紧密连接的完整性[50]。

有关GDF9与雄性生殖方面的研究相对较少。GDF9是否参与精子的获能和顶体反应、是否影响睾丸发育、是否影响雄激素生物合成以及其它物种精子的冷冻保存，都有待于进一步研究。

6 GDF9影响受精和胚胎发育

卵母细胞中正常的BMP15和GDF9表达水平对卵母细胞的细胞质成熟至关重要。GDF9+/-、BMP15-/-以及GDF9+/-BMP15-/-DM小鼠的MⅡ期卵母细胞受精率显著降低，着床前胚胎（2细胞至桑椹胚）发育滞后。这可能是通过降低BMP15和GDF9表达水平来影响卵丘细胞发育，也说明卵母细胞、颗粒细胞间的反馈调节环对正常的卵母细胞发育很重要[16]。

GDF9能提高绵羊[32]、牛[37]、猪[38]和小鼠[51]等的胚胎质量和发育能力，但不同物种间存在一定差异。与对照组相比，未成熟的绵羊COCs与重组的人GDF9共培养会降低卵裂率，对囊胚率无明显影响，而囊胚的滋养层细胞数显著增加[32]。GDF9重组蛋白能够提高克隆牛胚胎的卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率[37]。在猪卵母细胞体外成熟（in vitro maturation， IVM）培养过程中，外源添加GDF9能显著提高囊胚率[38]。在FSH和表皮生长因子（epidermal growth factor， EGF）存在下，外源添加GDF9能顯著提高小鼠卵母细胞的囊胚率和囊胚的内细胞团（inner cell mass， ICM）细胞数量，15天的成活胎儿数亦有增加[51]。

GDF9可能通过影响黄体形成和前列腺素合成在子宫内膜上皮的增殖与分化、胚胎着床、维持妊娠、启动分娩、胎盘形成和功能维持等方面发挥作用，关于GDF9是否影响卵母细胞的捕获、卵母细胞在输卵管的运输、黄体退化、胎盘结构和乳腺发育等，需要进一步研究。

另外，GDF9可能具有更广泛的生物学效应，虽然GDF9主要在卵巢的卵母细胞中表达，但它在其它性腺组织和非性腺组织中亦有表达[4]。GDF9在非性腺组织中也可能发挥重要的生理功能[7]。

7 应用展望

总之，GDF9通过影响生殖细胞和体细胞参与调节哺乳动物生殖过程的多个环节，发挥重要的自分泌和旁分泌作用。然而，GDF9在生殖系统中作用的研究才刚刚起步，还需要从分子生物学、细胞生物学和发育生物学等角度对其进行深入挖掘，揭示GDF9在生殖活动中的作用机制和调节方式，阐明哺乳动物的生殖机理，促进生殖生物学的发展，广泛应用于哺乳动物生殖调控和生殖疾病的诊断与临床治疗中。

另外，由于生殖过程的调节本来就是一个很复杂的过程，有很多影响因素参与调节，下丘脑-垂体-性腺轴内分泌调节和卵母细胞源旁分泌或自分泌因子（GDF9、BMP15和BMP6等）共同发挥重要调节作用。要研究哺乳动物整个生殖活动的调节机理，需要对生殖过程进行整体和系统研究，这样才有助于全面揭示哺乳动物复杂的生殖过程，为促进哺乳动物生殖健康和提高动物繁殖力提供理论依据和技术手段，推动生殖生物学研究以及动物繁殖、改良的发展和进步。

参 考 文 献：

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