华东地区蓝莓采后病害病原鉴定及其多样性分析

尉莹莹+梁晨+赵洪海+李宝笃

摘要：本试验以采自山东省日照市、青岛市及威海市和浙江省金华市的蓝莓果实为试材， 通过对采后病害病原菌的分离、鉴定、致病性测定及多样性分析，探究地区间蓝莓采后病原菌种类及其群落特征。分离鉴定结果表明：引起蓝莓采后病害的病原菌有链格孢（Alternaria alternata）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、根霉（Rhizopus sp.）、黑曲霉（Aspergillus niger ）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）、小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）、拟茎点霉（Phomopsis sp.）、枝状枝孢（Cladosporium cladosporioides）、辐毛小鬼伞（Coprinellus radians）、稻黑孢菌（Nigrospora oryzae）、球黑孢（Nigrospora sphaerica）、棒状拟盘多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）等12种真菌。多样性分析结果表明，蓝莓采后病原菌群落多样性丰富，其中链格孢是优势种，灰葡萄孢和根霉是亚优势种；4个采样地蓝莓采后病原真菌群落的多样性存在差异，其中金华地区的多样性指数（H′=1.5540）和均匀度指数（J=0.9658）均最高；4个地区间的蓝莓采后病原菌相似性系数较低，其中日照地区与青岛地区之间的相似性系数最高（Cj=0.4444），威海地区与金华地区之间的相似性最低（Cj=0.1428）。

关键词：蓝莓；采后病害；病原菌数量；种类组成；优势种；多样性指数；相似性系数

中图分类号：S436.639 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）07-0112-04

Abstract The blueberry fruits collected from Rizhao， Qingdao， Weihai of Shandong Province and Jinhua of Zhejiang Province were used as experimental materials in this test. In order to explore the species and community characteristics of blueberry postharvest pathogens from different origins， the isolation， identification， pathogenicity determination and diversity analysis of pathogens were carried out. The results showed that the blueberry postharvest rot diseases were caused by the following twelve fungi： Alternaria alternata， Botrytis cinerea， Rhizopus sp.， Aspergillus niger， Epicoccum nigrum， Pestalotiopsis microspora， Phomopsis sp.， Cladosporium cladosporioides， Coprinellus radians， Nigrospora oryzae， Nigrospora sphaerica and Pestalotiopsis clavispora. The diversity analysis results demonstrated that there was rich diversity in the blueberry postharvest pathogen community， of which， Alternaria alternata was the dominant species， and Botrytis cinerea and Rhizopus sp. were the subdominant species. There were obvious differences in postharvest fungal pathogen community diversities among four blueberry sampling sites， and Jinhua was the highest in Shannon diversity index （H′=1.5540） and Pielou evenness index （J=0.9658）. The similarity coefficients of blueberry postharvest pathogens among the four regions were low， among which， the similarity coefficient between Rizhao and Qingdao was the highest （Cj=0.4444）， while that between Weihai and Jinhua was the lowest （Cj=0.1428）.

Keywords Blueberry； Postharvest disease； Pathogen quantity； Specific composition； Dominant species； Diversity index； Similarity coefficient

藍莓（Vaccinium spp.），属于杜鹃花科 Vacciniaceae越橘属 Vaccinium，是一种具有极高经济价值的新兴世界性小浆果果树[1]。果实中含有丰富的维生素、多种氨基酸，还含有花青素、黄酮等多种酚类成分，上述成分导致蓝莓具有很强的抗氧化性及改善循环、提高免疫力、抗衰老、抗癌等多种生理活性功能[2]，被世界卫生组织认为是抗氧化性最强的水果之一，常被誉为“浆果之王”[3]。

蓝莓含水量高，采后果实易发生失水、腐烂等现象，极不耐贮藏[4]。这一特性限制了其商品货架期和商品价值。近年来，国内对蓝莓贮藏保鲜技术研究较多，但对采后病害的研究报道较少。2016年戴启东等[5]报道辽宁地区引起蓝莓采后病害的主要致病菌为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、链格孢（Alternaria sp.）、青霉（Penicillium sp.）及粉红单端孢（Trichothecium roseum）；2015年周笑犁等[6]报道贵州地区引起蓝莓采后病害的主要致病菌为拟盘多毛孢（Pestalotiopsis sp.）、新梭壳孢Neofusicoccum sp.、青霉（Penicillium sp.）、地霉（Geotrichum sp.）及枝顶孢（Acremonium sp.）；2015年郭晓月等[7]报道云南地区引起蓝莓贮藏期病害的致病菌为枝孢属（Cladosporium ）、链格孢属（Alternaria）及匍柄霉属（Stemphylium）真菌；2010年梁晨等[8]报道蓝莓贮藏期病害有灰葡萄孢、草酸青霉（Penicillium oxalicum）、褐孢霉（Fulvia fulvum）、链格孢（A. alternata）及基连枝顶孢（A. kiliense）。本研究以从华东四地采摘的蓝莓果实为研究对象，对引起蓝莓采后病害病原菌的种类和群落结构进行分析，以期为有效防治蓝莓采后病害提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2015年6—8月间，从山东省的日照市、青岛市、威海市及浙江省的金华市采摘成熟度相同、大小均勻的蓝莓鲜果。

1.2 蓝莓采后病害病原菌的分离与纯化

将果实放在25℃下贮藏，待果实自然发病后，按常规组织分离法[9]在发病果实病健交界处切取小块病组织，移在PDA培养基上25℃培养，待长出菌落后，采用玻璃毛细管分离法[9]进行单菌丝纯化，并保存菌株在PDA斜面上备用。

1.3 蓝莓采后病害病原菌致病性测定

参考赵淑艳等（2005）[10]的方法加以改良，分别采用有伤接种法和无伤接种法进行病原致病性测定。有伤接种法为选取成熟度和大小一致的果实用2%次氯酸钠浸泡5 min，用无菌水洗净，晾干，用昆虫针在果实果蒂处刺直径3 mm、深3 mm的伤口。将纯化好的病原菌，在PDA上培养7 d，待其产孢后，分别用无菌水制成1×106个/mL的孢子悬浮液。在每个果实伤口处接种10 μL孢子悬浮液。无伤接种法为直接接种相应病原菌的1×106 个/mL孢子悬浮液10 μL到果蒂处。以接种无菌水为对照，每处理10个果实，设3个重复。接种后将果实置于塑料盒中，25℃下保湿培养。7 d后观察并记录发病情况。

1.4 蓝莓采后病害病原菌鉴定

根据病原菌在PDA上的菌落形态及产孢结构特征，参照真菌鉴定手册[11]进行形态学鉴定；利用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）的通用引物ITS1和ITS4[12]以及相应的PCR条件对基因组DNA进行扩增，对病原菌进行分子鉴定。

1.5 多样性分析

分离频率用于比较和判断病原菌的优势种群，计算公式：分离频率（%）= 某一分离物的总数（株）/所有分离物总数（株）×100；各地区蓝莓采后病原真菌群落的多样性水平通过香农威纳指数（Shannon-Weiner index，H′）、Pielou均匀度指数（Pielous evenness index，J）及Margalef丰富度指数（D）进行分析，计算公式：H′=-∑si=1Pi×lnPi ；J= H′/Hmax，Hmax=-∑si=11/S×ln1/S = lnS，J=H/lnS；D=（S-1）/lnN，式中，Pi是第i种的个体数占总个体数的比例，N为总个体数，S为每个样品中的物种总数。

1.6 相似性分析

地区间蓝莓采后病原真菌群落组成的相似性水平通过Jaccrad相似性指数（Cj）来进行分析，其公式为：Cj=c/（a+b-c），式中，a、b分别为两种生境类型中病原菌种数，c为两种生境类型中共有的病原菌种数，用于比较两个生境中病原菌种类组成的相似程度[13，14]。

2 结果与分析

2.1 蓝莓采后病原菌种类与分离频率

由表1可知，从华东四市采集的蓝莓果实中所分离的采后病害的病原微生物均为真菌，共计212株，分属10 属12 种，其中，链格孢是优势种，其分离频率为71.70%；灰葡萄孢和根霉是亚优势种，分离频率分别为9.91%和5.66%；黑曲霉、黑附球菌、小孢拟盘多毛孢及拟茎点霉是第三大优势种群，分离频率分别为3.30%、2.83%、2.36%及1.42%；枝状枝孢、棒状拟盘多毛孢、稻黑孢、辐毛小鬼伞及球黑孢的分离频率均少于1.00%，是蓝莓采后病原菌的稀有种群。

由表2可知，不同地区蓝莓采后病原真菌群落组成和结构存在一定差异。在四个采集地中，日照蓝莓采后病原真菌的种类最多，为6属7种，其优势种群是链格孢，占日照总菌株数的相对分离频率为81.43%；从青岛蓝莓分离出采后病原真菌5属6种，其优势种群为链格孢，其次为灰葡萄孢和根霉，分别占青岛总菌株数的相对分离频率63.93%、16.39%及13.11%；从威海蓝莓中分离出采后病原真菌3属3种，其优势种群为链格孢，其次为灰葡萄孢，分别占威海总菌株数的相对分离频率86.67%和10.00%；从金华蓝莓分离出采后病原真菌5属5种，其优势种群为黑曲霉，占金华总菌株数的相对分离频率为33.33%。

2.2 致病性测定

无伤接种7 d后，致病性测定结果表明，蓝莓果实均不发病，说明蓝莓果实采后在不受外伤的情况下，病原菌很难侵染果实。

由表3可见，有伤接种均能使果实发生不同程度的腐烂，其中链格孢、灰葡萄孢、根霉和黑曲霉引起的发病率为100%，小孢拟盘多毛孢、拟盘多毛孢和枝状枝孢引起的发病率在70%～80%，其他病原菌引起的发病率在55%及以下。分别从有伤接种的发病果实上进行病原菌的再分离和培养，其分离率均为100%，未分离到非接种菌，说明发病蓝莓的腐烂是由所接种病原菌菌株侵染所致。

2.3 不同地区蓝莓采后病原真菌多样性特点

表4可见，四个地区蓝莓采后病原真菌群落间的多样性水平存在差异。从病原真菌的数量上看，日照地区的最高，共分离出7种真菌，而威海地区的最低，仅分离到3种真菌；从多样性水平来看，日照地区真菌的丰富度指数（D）最高，金华地区真菌的多样性指数（H′）和均匀度指数（J）均最高，分别为1.5540、0.9658。

2.4 不同地区间蓝莓采后病原真菌组成的相似性

表5可见，四个地区间蓝莓采后真菌群落相似性系数在0.1428～0.4444之间，日照与青岛两地蓝莓采后病原真菌群落相似性最高（0.4444），威海与金华两地蓝莓采后病原真菌群落相似性最低（0.1428）。根据Jaccrad相似性原理，各地区之间的真菌群落相似性系数处于极不相似与中等不相似之间。总体来看，四个地区蓝莓采后病原真菌群落间的相似度均较低。

3 讨论与结论

多样性指数可用来分析病原菌群落的多样性，均匀度指数是反映病原菌种群分布特点的重要指标，丰富度指数可用来反映病原菌种属丰富性特点，而相似性系数是反映两个不同地区间病原菌群落组成相似程度的重要指数。本研究对华东两省四市蓝莓典型代表产地进行分析，從四个产地的蓝莓果实中分离和鉴定出10属12种病原真菌，并且发现栽培地区不同，蓝莓采后病原菌数量、组成及群落多样性水平的差异较大，相似程度较低。

物种多样性指数、丰富度指数和均匀度指数与各地区的气候、土壤条件、当地的生产管理水平密切相关。山东三个产地虽然分布在沿海，但由于青岛和日照的空气洁净度低于威海，因此威海蓝莓果实采后病原真菌种类最少，而浙江金华的蓝莓产地地处山地，虽然周围的植物病原真菌较多，导致蓝莓采后病原真菌种类多于威海，但分离真菌菌株数最少；同时相对于其他三地，威海气温较低，也导致采后病原真菌多为不耐高温的真菌种类。同时链格孢和灰葡萄孢比较适合低温，是山东三地的优势种，而在黑曲霉更适应高温，因此是金华地区蓝莓采后病原真菌中的优势种。金华地区蓝莓采后病原真菌的多样性指数、均匀度指数及丰富度指数均较高，说明该地区的环境适合空气微生物发生和繁殖。从真菌组成相似性来看，日照和青岛的相似性最高，威海与金华最低，说明威海与金华之间真菌组成差异性较大。

参 考 文 献：

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