富锗酵母蛋白粉对细菌生长及部分生物学特性的影响

张腾腾， 张 涵， 李太元， 张 敏， 许广波， 李艳茹

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133002)

富锗酵母蛋白粉对细菌生长及部分生物学特性的影响

张腾腾， 张 涵， 李太元， 张 敏， 许广波， 李艳茹*

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133002)

为了研究富锗酵母蛋白粉对细菌生长及部分生物学特性的影响，选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的标准菌株作为受试菌种，进行富锗酵母蛋白粉对细菌的增菌、耐盐性、酸碱耐受性、温度耐受性的影响以及其对嗜酸乳杆菌产酸和抑菌效果的影响等试验。结果表明：富锗酵母蛋白粉对嗜酸乳杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有增菌作用，其最适作用浓度分别为1、1、4、4 mg/mL。富锗酵母蛋白粉能一定程度地提高细菌的耐酸碱能力、胆盐耐受能力及温度耐受能力，提高嗜酸乳杆菌的产酸量和其细菌素对大肠杆菌的抑菌效果。本试验为富锗酵母蛋白粉在饲料中的添加提供一定的理论基础。

富锗酵母蛋白粉；酵母蛋白粉；细菌；生长；生物学特性

微生物蛋白质又称单细胞蛋白(single cell protein ,SCP),具有高蛋白质、多氨基酸、低脂等特点，并可以从废物中产生[1]。酵母蛋白是干燥益生菌酵母除去多糖等其他成分富集而成的一种功能性蛋白，主要是菌体蛋白及酵母代谢产物，富含小肽、氨基酸、核苷酸、谷氨酸盐和肌醇等养分[2]。有机锗具有抗炎等药理作用，并且在癌症、关节炎和骨质疏松症的治疗方面有一定功效[3]。富锗酵母蛋白粉为基本无毒食品，可作为食品功能基料广泛应用于食品工业和保健领域中[4]。乳酸菌作为动物肠道的正常菌群，在维持动物肠道的微生态平衡和调节动物代谢方面发挥重要作用[5]。枯草芽孢杆菌在动物肠道内具有抑制致病菌生长和促进有益菌生长的双重功能[6]。大肠杆菌在正常情况下对健康有益，一旦增殖失控，或从肠道转移到身体其他部位，就可能引发许多问题。金黄色葡萄球菌是临床感染性疾病最常见的病原菌，可引起皮肤软组织、下呼吸道及血液系统等多种部位的感染，尤其是医院感染较常见的病原菌[7]。本试验把4种细菌添加到含富锗酵母蛋白粉的培养基中，研究富锗酵母蛋白粉对细菌生长及特性的影响，为进一步开发研究富锗酵母产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1菌种来源

大肠杆菌(Escherichiacoli编号：1.2385)；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis编号：63510)；嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus编号：1.1854)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus编号：1.0089)。均购自中国科学院微生物研究所。

1.2药品与试剂

富锗酵母蛋白粉、酵母蛋白粉(由延边大学农学院动物营养实验室提供)；普通肉汤培养基(购自青岛高科园海博生物技术有限公司)；MRS肉汤培养基，琼脂粉，LB肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)。

1.3 菌悬液制备

挑取复活在固体培养基上的菌落于液体培养基(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌使用LB肉汤，嗜酸乳杆菌使用MRS肉汤，下同)，37 ℃培养24～48 h，用生理盐水稀释菌悬液，使其OD值为0.7±0.1[8]，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.4 富锗酵母蛋白粉对细菌增殖的影响

用普通肉汤把富锗酵母和酵母蛋白粉分别配成质量浓度为0、0.1%～1.0%的溶液，使其总体积为1 mL(下同)。每管添加菌悬液20 μL，37 ℃恒温培养24～48 h，嗜酸乳杆菌作厌氧培养(下同)。利用稀释涂布平板法对细菌进行计数(下同)。重复3次，取平均值，分析富锗酵母蛋白粉的增殖和最适作用浓度。

1.5 酵母蛋白粉对细菌耐胆盐能力的影响

用最适浓度的富锗酵母蛋白粉肉汤(标记为F)配制胆盐浓度分别为0、0.1%～0.5%的溶液，另做酵母蛋白粉对照组(标记为J)和肉汤对照组(标记为L)。每管添加菌悬液20 μL，37℃恒温培养24～48 h，并计数。重复3次，取平均值，分析富锗酵母对细菌耐胆盐能力的影响。

1.6 富锗酵母蛋白粉对细菌酸碱耐受性的影响

配富锗酵母蛋白粉、酵母蛋白粉对照组和肉汤对照组3组肉汤培养基，每组6管，并分别用1 mol/L的HCl和NaOH溶液调整培养基的pH值至2、4、6、7、9、10，每管添加菌悬液20 μL，37 ℃培养24～48 h，并计数。重复3次，取平均值，分析富锗酵母蛋白粉对细菌酸碱耐受性的影响。

1.7 富锗酵母蛋白粉对细菌生长曲线的影响

配富锗酵母蛋白粉、酵母蛋白粉对照组和肉汤对照组3组肉汤培养基，每组20 mL，并调整pH值至最适，分别添加菌悬液400 μL，37℃恒温培养。枯草杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌每隔2 h、嗜酸乳杆菌每隔3 h取1 mL菌液，计数。重复3次，取平均值，分析富锗酵母蛋白粉对细菌生长曲线的影响。

1.8 富锗酵母蛋白粉对细菌温度耐受性的影响

配富锗酵母蛋白粉、酵母蛋白粉对照和肉汤对照组3组肉汤培养基，每组10管，每管添加菌悬液20 μL，分别置于40、60、80 ℃ 3个梯度的水浴中，均处理10、20、30 min，37 ℃恒温培养24～48 h，并计数。重复3次，取平均值，分析富锗酵母蛋白粉对细菌温度耐受性的影响。

1.9 富锗酵母蛋白粉对嗜酸乳杆菌产酸的影响

配富锗酵母蛋白粉、酵母蛋白粉对照组和肉汤对照组3组肉汤培养基，每组100 mL，分别添加菌悬液2 mL，混匀后37 ℃恒温培养，每隔3 h取5 mL菌液测pH值。重复3次，取平均值，分析富锗酵母蛋白粉对嗜酸乳杆菌产酸的影响。

1.10 富锗酵母蛋白粉对嗜酸乳杆菌细菌素抑菌效果的影响

配富锗酵母蛋白粉、酵母蛋白粉对照组和肉汤对照组3组肉汤培养基，每管体积为10 mL，每管加嗜酸乳杆菌菌悬液200 μL，混匀后37 ℃恒温培养48 h，3 000 r/min离心5 min，取上清液。利用牛津杯法，测3组细菌素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径。重复3次，取平均值，分析富锗酵母蛋白粉对嗜酸乳杆菌细菌素抑菌效果的影响。

2 结果与分析

2.1 富锗酵母蛋白粉浓度对细菌增殖的影响

由图1可知，富锗酵母蛋白粉有促进细菌生长的作用，其作用效果要比酵母蛋白粉好(除嗜酸乳杆菌外)，富锗酵母蛋白粉对嗜酸乳杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的最适作用浓度分别为1,1,4,4 mg/mL，而酵母蛋白粉的最适浓度分别为5,3,2,2 mg/mL。

图1 蛋白粉浓度对细菌的影响Fig.1 The effects of protein powder concentration on bacteria

2.2 富锗酵母蛋白粉对细菌耐胆盐作用的影响

富锗酵母蛋白粉降低了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的胆盐耐受能力；提高了枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的胆盐耐受能力(图2)。

图2 蛋白粉对细菌胆盐耐受能力的影响Fig.2 The effects of protein powder on the salt tolerance of bacteria

2.3 富锗酵母蛋白粉对细菌酸碱耐受性的影响

富锗酵母蛋白粉提高了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和嗜酸乳杆菌的耐酸碱能力，且富锗酵母蛋白粉比酵母蛋白粉对细菌耐酸能力提高幅度大(图3)，尤其是pH值为6时。

图3 蛋白粉对细菌酸碱耐受能力的影响Fig.3 The effects of protein powder on acid and alkali tolerance of bacteria

2.4 富锗酵母蛋白粉对细菌生长曲线的影响

由图4可知，富锗酵母蛋白粉延长了金黄色葡萄球菌对数期(由8～14 h至4～20 h)，缩短了金黄色葡萄球菌的适应期(由0～8 h至0～4 h)；缩短了大肠杆菌的适应期(由0～10 h至0～4 h)，延长了其对数生长期；延长了枯草杆菌的适应期(由0～14 h至0～18 h)，但是提高了其对数期的生长速度；缩短了嗜酸乳杆菌的适应期(由0～15 h至0～12 h)，但提高了对数生长期的生长速度(图5)。

图4 蛋白粉对细菌生长曲线的影响 图5 蛋白粉对嗜酸乳杆菌生长曲线的影响Fig.4 The effects of protein powder on bacterial growth curve Fig.5 The effects of protein powder on L. acidophilus growth curve

2.5 富锗酵母蛋白粉对细菌温度耐受性的影响

由图6可知，富锗酵母蛋白粉不同程度地提高了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和嗜酸乳杆菌的温度耐受性。但在40 ℃ 30 min时，蛋白粉的添加降低了大肠杆菌的温度耐受性。对嗜酸乳杆菌而言，富锗酵母组对温度耐受性的提高幅度大于酵母组。

图6 蛋白粉对细菌温度耐受能力的影响Fig.6 The effects of protein powder on temperature tolerance of bacteria

2.6 富锗酵母蛋白粉对嗜酸乳杆菌产酸的影响

随着时间的延长，菌液pH值逐渐下降。在42～48 h时，各组pH值趋于稳定，且酵母组的pH

值<富锗酵母组的pH值<对照组的pH值(图7)。这说明富锗酵母蛋白粉提高了嗜酸乳杆菌的产酸能力，但提高幅度低于酵母蛋白粉。

图7 蛋白粉对嗜酸乳杆菌产酸的影响Fig.7 The effects of protein powder on acid production of L. acidophilus

2.7 富锗酵母蛋白粉对嗜酸乳杆菌细菌素抑菌效果的影响

由图8可知，富锗酵母组乳酸菌素对大肠杆菌的抑菌直径均大于对照组，但小于酵母组，说明富锗酵母蛋白粉提高了乳酸菌素对大肠杆菌的抑制作用，但其幅度不如酵母蛋白粉；富锗酵母蛋白粉对乳酸菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用几乎没有影响。

图8 蛋白粉对嗜酸乳杆菌细菌素抑菌效果的影响

3 讨论与结论

微生物蛋白为细菌提供营养物质，对细菌的生长繁殖起着重要的影响。富锗酵母是集酵母的高营养、有机锗的免疫调节和抗肿瘤功能于一身的高附加值功能食品[4]。本次试验发现富锗酵母蛋白粉能促进细菌生长，缩短菌株生长周期和提高菌体增殖速度。但高剂量时对受试菌的促生长作用降低甚至起抑制作用。苏琦表明抗菌肽可以在细胞膜上形成穿膜孔道，使膜快速去极化，引起细菌死亡[9]。高剂量富锗酵母蛋白粉的抑制机制是否与其肽的含量有关，还需进一步研究。

胆盐随肝胆汁排至小肠，影响肠道胆盐浓度[10]。动物实验及临床证实胆盐有抑制细菌生长的作用[11]。本次试验发现富锗酵母蛋白粉提高了嗜酸乳杆菌和枯草杆菌的胆盐耐受能力。Smet I D等人指出，胆盐能够以分子的形式通过被动扩散进入细胞，然后在细胞质中释放氢离子使细胞内酸化，从而引起细菌的死亡。细菌可以利用ATP所生成的H+—三磷酸腺苷来驱逐质子以调节细胞质的pH值，从而减轻胆盐的毒害作用[12]。由此可以推测富锗酵母蛋白粉可能为细菌提供了大量的ATP来源，从而提高了细菌的胆盐耐受力。

随着摄入食物的变化，胃肠道内的pH值也随之发生变化，胃酸的分泌造成胃内酸性环境，影响细菌的生长。本次试验表明,富锗酵母蛋白粉可以不同程度的提高细菌的酸碱耐受能力。田会芹表明,pH值的改变会引起细胞膜电荷变化，进而影响细菌对营养物质的吸收[13]。因此,可以猜测富锗酵母蛋白粉可能保护了细菌细胞膜电荷的变化，从而提高了细菌的酸碱耐受性。

温度对细菌生长繁殖有较大影响，过高的温度可以杀死细菌。环境温度会影响活菌制剂的生产、运输、保存及使用。该试验结果显示,富锗酵母蛋白粉提高了细菌的温度耐受性。菌体蛋白质(包括酶类)因加热而发生变性或凝固，活性消失、代谢发生障碍，因而导致细菌死亡。由此推测蛋白粉可能补充了蛋白质，从而提高了细菌的温度耐受性。

乳酸菌产酸功能是一个很重要的指标，酸可使胃内蛋白酶原激活，同时酸具有强的杀菌作用[14]。乳酸菌产生的有机酸可以降低其他杂菌细胞间质的pH值破坏其渗透压，以及破坏杂菌的细胞膜进入细胞内干扰其活动从而产生抑菌作用[15]。本次试验发现富锗酵母蛋白粉可以一定程度的提高嗜酸乳杆菌的产酸能力及其对大肠杆菌的抑制作用。其抑菌机制可能是提高了产酸量从而抑制了大肠杆菌的生长。

富锗酵母蛋白粉对嗜酸乳杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有增菌作用，其最适作用浓度分别为1、1、4、4mg/mL。富锗酵母蛋白粉能一定程度的提高细菌的耐酸碱能力、胆盐耐受能力及温度耐受能力，提高嗜酸乳杆菌的产酸量和其[][]

细菌素对大肠杆菌的抑菌效果。畜禽可以通过食用添加富锗酵母蛋白粉的饲料，提高肠道对营养物质的吸收能力，从而提高饲料利用率，提高畜禽的产量。本试验为富锗酵母蛋白粉在饲料中的添加提供一定的理论基础。

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Effect of germanium-enriched yeast protein powder on the growth and biological characteristic of intestinal bacteria

ZHANG Tengteng, ZHANG Han, LI Taiyuan, ZHANG Min, XU Guangbo, LI Yanru*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In order to study the effect of germanium-enriched protein powder on the growth and biological characteristic of intestinal bacterial, the standard strains ofEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,BacillussubtilisandLactobacillusacidophiluswere selected as tested bacteria strains. We evaluated the effects of germanium-enriched yeast protein powder on the growth, salt tolerance, acid-base tolerance, temperature tolerance of the tested bacteria stains, and checked the effects on the acid production and bacteriostasis ofL.acidophilus. The results showed that the germanium-enriched yeast protein powder stimulated the growth ofL.acidophilus,B.subtilis,S.aureus,E.coli, and the most suitable concentrations of germanium powder were 1, 1, 4 and 4 mg/mL, respectively. The germanium-enriched yeast protein powder could improve the ability of acid-resistance and alkali-resistance, bile salt tolerance and temperature tolerance of the tested bacteria, and increase the acid production ofL.acidophilusand the bacteriostasis effect of bacteriocin onE.coli. The results provide a theoretical basis for the application of the germanium-enriched yeast protein powder in feed additives.

Germanium-enriched yeast protein powder; yeast protein powder; bacteria; growth; biochemical characteristics

2017-03-27 基金项目：吉林省科技厅重点项目(20110236)

张腾腾(1991—)，女，河南永城人，在读硕士，研究方向为兽医微生物与免疫学，李艳茹为通信作者，

E-mail：hmwang@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)02-0060-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.010

TQ936

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