枝顶孢霉对南方根结线虫的防治效果

路鹏鹏，孙晓宇，陈 锐，瞿 佳，赵玲侠，韩丽萍，沈卫荣

（陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043）

枝顶孢霉对南方根结线虫的防治效果

路鹏鹏，孙晓宇，陈 锐，瞿 佳，赵玲侠，韩丽萍，沈卫荣

（陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043）

以室内生物测定检测枝顶孢霉悬液对南方根结线虫二龄幼虫的致死率，在黄瓜砧木上，以盆栽试验和温室小区试验检测枝顶孢霉粉剂对南方根结线虫病的防效。结果表明，室内生物测定枝顶孢霉悬液对南方根结线虫的最高致死率为89.7%，毒力曲线为y=-7.5989+1.717826x，R2=0.9960，LC50=2.15×107CFU/ mL；盆栽试验最佳防效为药后14 d，防效为15.38%～31.57%，各处理有剂量-效应关系，对黄瓜砧木生长有促进作用。温室小区最佳防效为药后120 d，防效为80.47%～84.38%。枝顶孢霉粉剂对南方根结线虫有一定的防效，同时可以促进黄瓜砧木的生长，需要在早期病害较轻时施用，药后4个月左右需要补施一次。

枝顶孢霉；南方根结线虫；生物测定；防治效果

作为世界性病害，植物线虫病每年使全球作物减产12.3%，经济损失高达1 210亿美元。由于化学杀线剂对环境的潜在危险，近25年其在世界范围内的注册量正在下降，而对环境友好的真菌杀线虫剂是化学杀线虫剂重要的替换资源［1］。根结线虫是我国最重要的植物病害线虫，近年来随着设施农业的迅猛发展，根结线虫病愈发严重，已经成为我国设施农业发展的严重阻力。根结线虫病源真菌是防治根结线虫病的重要资源，全世界报道的根结线虫病源真菌种类400多种，中国报道的根结线虫病源真菌200多种［2］。欧盟食品安全局（http：//ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eupesticides-database/public/?event=activesubstance. selection&language=EN）登记注册杀线剂为50个，其中可查信息显示的微生物杀线虫剂2个，分别为淡紫拟青霉和坚强芽孢杆菌；国内杀线虫剂登记注册的数量为158个，在可查信息中微生物杀线虫剂5个，有效成分分别为厚孢轮枝菌、淡紫拟青霉和蜡质芽孢杆菌（http：//www.chinapesticide.gov.cn/hysj/index.jhtml）。根结线虫病源真菌商品的登记注册，是其由资源向生产力转化的重大突破，但是从注册情况可以看出，真菌杀线剂无论是注册商品数还是有效成分数量均较少，而生物杀线虫剂近几年市场复合增长速率约为4.2%［3］，新型病源真菌资源的挖掘利用是新型微生物杀线剂开发的关键点，巨大的市场需求为新型病源真菌开发提供了巨大动力。

枝顶孢霉多为植物内生型生防菌，我国记录种有13个［4］，对根结线虫、松材线虫、菜青虫、蚜虫、二斑叶螨、杨干象、青阳天牛和黄斑星天牛等多种害虫具有致病性［5-10］。其在线虫防治上的研究相对淡紫拟青霉和厚孢轮枝菌等已经有注册商品的生防真菌较少，是一种新型的根结线虫病源真菌。孙建华等［5-6，11］研究了枝顶孢霉BH0531对根结线虫和松材线虫的影响，发现有机氮源有利菌种生长，无机氮源发酵液对线虫致死率高，其发酵液对松材线虫乙酰胆碱酯酶有较强的抑制作用，并在盆栽条件下研究了该菌对黄瓜多种活性酶的影响。史晓讯等［12］优化了枝顶孢霉MTJ5-3-1的培养条件，提高其对根结线虫的致死率，并分析得出其代谢活性物质具有含氮糖类或含氮糖类衍生物的分子特征。Yao等［13］构建了枝顶孢霉的GFP标记，标记突变株与野生型在根结线虫二龄幼虫和卵的侵染力无差异，为枝顶孢霉与植物共生和对根结线虫的侵染提供了一种工具。马玉琴等［14］以枝顶孢霉等4种真菌与有机肥复配制成生防型有机肥，提高其对根结线虫的防治效果和黄瓜的产量。GoswamiJ等［15］发现枝顶孢霉和被感染番茄的根围密切相关，黑曲霉在枝顶孢霉和哈茨木霉分泌毒性物质侵染卵时对南方根结线虫有毒性，枝顶孢霉和哈茨木霉无论是单独还是共同使用对促进番茄生长和根结线虫防效均有显著作用。林森等［16］研究发现枝顶孢霉菌WLE1可以产几丁质酶并以活性电泳测定了几丁质酶的分子量，其粗酶液对南方根结线虫卵、二龄幼虫及雌虫均有抑制。枝顶孢霉菌种由本实验室分离于根结线虫病害严重的设施蔬菜土壤，通过室内毒力检测、盆栽试验和温室小区试验对南方根结线虫防效进行评价。

1 材料与方法

1.1 试验材料

温室小区试验设在陕西省科学院渭南科技示范基地，冯村镇平王村日光温室，根结线虫发生严重，面积560 m2，土壤类型为垆土，pH 7.9，相对体积质量1.31～1.32，饱和含水量32.1%～33.2%。供试作物为黄瓜砧木，2014年10月下旬育苗，11月上旬起垄（垄高15～18 cm）覆膜定植，常规管理。

病原线虫：南方根结线虫采自陕西省科学院渭南科技示范基地东埝村日光温室内黄瓜上。经过雌虫会阴花纹鉴定为南方根结线虫，挑取单卵囊并用 0.4% NaClO消毒后，接种于黄瓜易感病品种津春4号上进行扩繁，培养温度为25～28℃，接种45 d后，黄瓜根系上有大量卵囊出现，取带有大量卵囊的根系，自来水轻轻冲洗干净，用解剖针轻轻挑取病根上的卵囊，放入直径6 cm的小培养皿内，加入少量无菌水，在25℃恒温箱中孵化3～4 d，每隔24 h换水1次，收集二龄幼虫（J2）用无菌水将其稀释成浓度为500条/mL的悬浮液备用。

供试药剂：40亿孢子/mL枝顶孢霉悬液（APY），陕西省微生物研究所自制。将40亿孢子/mL枝顶孢霉悬液分别稀释成32、64、128、256、512倍药液，配制成5个浓度梯度：1.25× 108、6.25×107、3.13×107、1.56×107、7.81×106CFU/ mL。枝顶孢霉固体发酵物粉碎后与助剂配制成40亿孢子/g枝顶孢霉粉剂（APF）。1.8%阿维菌素（AW），济南泰禾化工有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 室内生物测定 枝顶孢霉设置5个浓度处理，另设清水对照，每个处理3次重复。取24孔生化测试板，各取1 mL供试药液置于小孔中，加入等体积的线虫悬浮液，空白对照加入等量清水，处理24 h后检查南方根结线虫二龄幼虫的存活数量和死亡数量，每次平行测定结果之差不应大于20%；样品各剂量引起的死亡率应在10%～90%之间，对照死亡率应小于10%，如果大于10%应该重新测定，计算死亡率和校正死亡率，并将处理浓度换算成对数值，校正死亡率参照“生物统计概率值换算表”转换成死亡几率值，用最小二乘法求出样品致死中浓度LC50和LC95。

1.2.2 盆栽药效试验 试验设APF 2、4、8 g/株和AM10 mL/株及清水对照5个处理，将灭菌土与根结线虫悬浮液按500︰2体积比混合均匀作为病土，病土二龄幼虫密度为每100 g土200条幼虫。取75 kg病土分别与生防菌100、200、400 g均匀混合，将混合好的处理土装入直径 8 cm、高15 cm的营养杯中。将黄瓜砧木种子提前催芽，每杯埋入5粒种子，地膜覆盖，田间条件下生长。接种后每7 d取样观察1次，每次各取10盆，约50株，共取样5次，将黄瓜砧木苗取出清洗根部，统计发病率及病情指数，计算防治效果，并测量地上茎部高度及根系长度。

根结线虫病情分级标准［17］：0级，无根结，根系健康；1级，仅有少量根结，根结占全根系的10% 以下；3级，根结明显，根结占全根系的11%～21.8%；5级，根结特别明显，根结占全根系的26%～50%；7级，根结数量很多，根结占全根系的51%～71.8%，根结相互连接，主根和侧根变粗并呈畸形；9级，根结数量特多，根结占全根系的71.8%以上，根结之间相互连接，多数主根和侧根变粗并呈畸形，甚至腐烂。

1.2.3 温室小区药效试验 试验设（667 m2用量）枝顶孢霉粉剂4、8、12 kg和1.8%阿维菌素1 000倍液500 mL及清水对照5个处理，每个处理3次重复，每个重复黄瓜砧木12株，随机区组排列，施药方法为穴施。处理10 d后定植黄瓜，药后60、80、120、150 d平行线法取样调查，每个小区取样5株，统计病情指数。

室内毒力生物检测数据采用Excel处理，盆栽试验和温室小区试验数据用DPS软件处理。

2 结果与分析

2.1 室内生物测定

室内生物测定24 h后，南方根据线虫死亡率随40亿孢子/mL枝顶孢霉悬液处理变化而改变。各处理间死亡率均有显著差异，死亡率最高为APY32倍液处理，南方根结线虫死亡率达89.7%（表1）。通过表1的浓度对数和死亡概率值，采用Excel进行回归分析得出枝顶孢霉悬液对南方根结线虫的毒力曲线为y=-7.5989+1.717826x，R2=0.9960，经计算得出LC50为2.15×107CFU/mL、LC95为1.96×108CFU/mL。

表1 枝顶孢霉悬液对南方根据线虫的致死率

2.2 盆栽药效试验

枝顶孢霉粉剂对南方根结线虫防效在各个时期均呈现出剂量—效应关系，各处理基本在药后14 d时药效最高，防治效果为15.38%～31.57%，施药28 d后药效较低。与对照药剂1.8%阿维菌素相比，枝顶孢霉粉剂在8g/株剂量水平与其药效相当（表2）。枝顶孢霉粉剂各处理在盆栽28d时的株高和根系长度均显著大于阿维菌素和对照，由于阿维菌素的药效高于枝顶孢霉粉剂2 g/株、4 g/株的水平，所以枝顶孢霉粉剂对黄瓜砧木生长有促进作用（表3）。

表2 盆栽试验各处理对南方根结线虫的防治效果

表3 盆栽试验各处理盆栽28 d黄瓜砧木生长情况

2.3 温室小区药效试验

从表4可以看出，施药后60 d和80 d，各处理均未发病，病情指数均为0。施药后120 d，枝顶孢霉各处理防效为80.47%～84.38%，均高于对照药剂1.8%阿维菌素，各处理药效和枝顶孢霉粉剂浓度表现出剂量-效应的趋势。施药后150d，枝顶孢霉粉剂各处理防效为14.56%～22.19%，各处理防效和枝顶孢霉粉剂浓度呈现出剂量-效应关系。

3 结论与讨论

室内生物检测结果显示，枝顶孢霉悬液对南方根结线虫最高致死率可达89.7%，LC95为1.96×108孢子/mL，与登记注册淡紫拟青霉和厚孢轮枝菌产品孢子含量相当，而室内试验最高致死率的孢子浓度约为1.25×108孢子/mL，廖金玲等［17］提出，田间药效评价防治效果达80%以上的杀线剂就有推广的潜力，虽然田间试验药效要低于室内试验，淡紫拟青霉、后孢轮枝菌等生防制剂田间防效多在20%～60%［14，18］，在灭菌土中的防效在34 %～93 %［19］，所以枝顶孢霉是具有防治根结线虫应用潜力的根结线虫病源菌株。

表4 温室小区试验各处理对南方根结线虫的防治效果

盆栽试验中枝顶孢霉粉剂对南方根结线虫显示出一定的防治效果，最高防效为施药后14 d的31.57%，比对照杀线剂1.8%阿维菌素1 000倍液防效略高，可减缓黄瓜砧木病情指数的增高。温室小区试验药效期约为120 d，最高防效为84.38%。盆栽和温室小区试验防效有差异，可能是土壤线虫数目差异所致，根结线虫初始密度越大，其侵染速度越快，病害越严重［20-21］。盆栽试验土壤线虫含量为200条/100g，温室小区土壤线虫含量为100条/100g，盆栽土壤线虫含量接近田间土壤线虫含量的2倍。黄瓜根结线虫病害损失阈值为100～209条/ 100 cm2，略低于盆栽试验病土，与温室小区试验病土相当，表明枝顶孢霉粉剂在黄瓜根结线虫病害达到损失阈值前使用可以取得良好的防治效果。温室小区在药后150 d时，防效在14.56%～22.93%，此时枝顶孢霉粉剂在土壤中的防效较低，表明其在田间防效期约为120 d。盆栽试验和温室小区试验防效差异较大以及后者试验末期防效大幅降低，显示根结线虫病害程度对试验结果影响较大，而线虫危害程度会随农作物周期发生变化，因此需要在根结线虫病害较轻的早期施药，并在施药后4个月左右补施一次。同时，枝顶孢霉粉剂对黄瓜砧木生长有促进作用，因此将生防菌剂与有机肥配制成生防型菌肥，同时提高线虫防治效果和黄瓜产量，是提高生防真菌应用的一种有效途径［16］。

［1］ Degenkolb T，Vilcinskas A. Metabolites from nematophagous fungi and nematicidal natural products from fungi as alternatives for biological control. Part II：metabolites from nematophagous basidiomycetes and non-nematophagous fungi［J］. Applied microbiology and biotechnology. 2016，100（9）：3813-3824.

［2］ 莫明和，牟贵平. 利用食线虫真菌防治植物寄生线虫的研究进展［J］. 大理学院学报，2009（12）：71-76.

［3］ 邱德文. 生物农药的发展现状与趋势分析［J］.中国生物防治学报，2015（5）：679-684.

［4］ 王有智，郭芳，周宇光. 中国的枝顶孢属（英文）［J］. 菌物系统，2002（2）：192-195.

［5］ 黄敏，刘晓霞，申佩娟，等. 海洋枝顶孢霉BH0531对黄瓜根结线虫防治的微生态效应［J］. 中国酿造，2016（3）：52-56.

［6］ 杜海霞，蒙春蕾，王勇勇，等. 海洋枝顶孢霉BH0531代谢物对松材线虫形态和酶活的影响［J］. 中国酿造，2014（6）：23-26.

［7］ 陈娥. 顶孢霉可湿性粉剂和微粉剂的药效评价及田间应用技术研究［D］. 兰州：甘肃农业大学，2016.

［8］ 侯爱菊，刘二曼，胜军. 杨干象寄生菌—— 枝顶孢霉的初步研究//中国虫生真菌研究与应用（第二卷）［C］. 北京：中国植物保护学会生物入侵分会，1991.

［9］ 樊美珍，郭超，燕新华. 从青杨天牛分离的几种致病真菌［J］. 真菌学报，1987（2）：97-102.

［10］ 周嘉熹，唐明，孜那提古丽，等. 黄斑星天牛幼虫期致病菌的研究［J］. 西北林学院学报，1992（3）：7-11.

［11］ Meng Q，Shi X，Meng F，et al. Isolation of an Acremonium sp. from a screening of 52 seawater fungal isolates and preliminary characterization of its growth conditions and nematicidal activity［J］. Biotechnology letters，2012，34（10）：1847-1850.

［12］ 史晓讯. 丝状海洋真菌杀线虫代谢物的性质及发酵条件研究［D］.天津：天津师范大学，2010.

［13］ Yao Y R，Tian X L，Shen B M，et al. Transformation of the endophytic fungusAcremonium implicatumwith GFP and evaluation of its biocontrol effect against Meloidogyne incognita［J］. World journal of microbiology & biotechnology，2015，31（4）：549-556.

［14］ 马玉琴，魏偲，茆振川，等. 生防型菌肥对黄瓜生长及根结线虫病的影响［J］. 中国农业科学，2016（15）：2945-2954.

［15］ Goswami J，Pandey R K，Tewari J P，et al. Management of root knot nematode on tomato through application of fungal antagonists，Acremonium strictum and Trichoderma harzianum［J］. Journal of environmental science and health. Part. B，Pesticides，food，2008，43（3）：237-240.

［16］ 林森，武侠，曹君正，等. 产生几丁质酶的交枝顶孢（Acremonium implicatum）对南方根结线虫生防潜力［J］. 植物病理学报，2013（5）：509-517.

［17］ 廖金铃，周慧娟，冯志新，等. 杀线剂田间药效试验中的问题及对策［J］. 农药科学与管理，2001（S1）：33-34.

［18］ 席先梅，白全江，张庆萍，等. 5种生物制剂对设施蔬菜根结线虫防治技术研究［J］. 植物保护，2015（4）：203-207.

［19］ 汪来发，杨宝君，李传道. 寄生真菌对根结线虫的致病力评价［J］. 林业科学，1999（3）：43-49.

［20］ Kiewnick S，Sikora R A. Evaluation of Paecilomyces lilacinus strain 251 for the biological control of the northern root-knot nematode Meloidogyne hapla Chitwood［J］. Nematology，2006，8（1）：69-78.

［21］ 张锋，李英梅，洪波，等. 温度和初始接种量对南方根结线虫侵染力的影响［J］. 中国生态农业学报，2012（12）：1631-1635.

（责任编辑 杨贤智）

Control efficiency of Acremonium sp. against Meloidogyne incongnita

LU Peng-peng，SUN Xiao-yu，CHEN Rui，QU Jia，ZHAO Ling-xia，HAN Li-ping，SHEN Wei-rong
（Microbiology Institute of Shaanxi，Xi’an 710043，China）

The lethality of secondary stage juvenile ofMeloidogyne incongnitawas detected with the variation of suspension concentration ofAcremoniumsp. by indoor bioassay，and the control efficiency ofAcremoniumsp. powder againstM. incongnitawas detected by pot experiment and greenhouse area test in cucumber root stock. Indoor bioassay results showed that the highest mortality ofM. incongnitawas 89.7%，the log dosage probability line （LD-P）was as follows:y=-7.5989+1.717826x，R2=0.9960，the median lethal concentration （LC50） was 2.15×107CFU/mL. The pot experiment results showed that the best control effect time was 14 days after drug treatment，with control efficiency of 15.38%-31.57%，there was dose-effect relationship，and it could promote the growth of cucumber rootstock. The greenhouse test results showed that，the best control effect time was 120 days after drug treatment，with control efficiency of 80.47%-84.38%. It was concluded thatAcremoniumsp. powder had control efficiency againstM. incongnita，while it could promote the growth of cucumber rootstock. The powder must be applied in early when disease was lighter，and be applied again after 4 months.

Acremoniumsp.；Meloidogyneincongnita；bioassay；control efficiency

S482.2+92

A

1004-874X（2017）04-0113-05

路鹏鹏，孙晓宇，陈锐，等. 枝顶孢霉对南方根结线虫的防治效果［J］.广东农业科学，2017，44（4）：113-117.

2017-02-14

陕西省科学院重大专项（2012k-03）；陕西省科学院青年人才培养专项（2014k-30）；陕西省农业科技创新项目（2012NKC02-14）；陕西农业科技创新与攻关项目（2015NY088）

路鹏鹏（1983-），男，助理研究员，E-mail：luppeng@163.com；

沈卫荣（1954-），男，研究员，E-mail：shenweirong@21cn.com