姜黄素对急性游泳训练小鼠骨骼肌损伤的保护作用

高 超，刘 阳，赵 佳，张雪松，王宇飞，杨月欣

(中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京 100050)

姜黄素对急性游泳训练小鼠骨骼肌损伤的保护作用

高 超，刘 阳，赵 佳，张雪松，王宇飞，杨月欣

(中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京 100050)

目的：探讨姜黄素对急性游泳训练小鼠骨骼肌损伤的保护作用。方法：成年雄性BALB/C小鼠随机分为安静对照组、运动对照组、运动+姜黄素组[100 mg/(kg·d)]和安静+姜黄素组[100 mg/(kg·d)]。干预期为4w，干预期最后1w同时进行游泳运动训练，每天训练90min，采用以上运动方式连续运动7d，末次运动完成后即刻处死小鼠。测定血清肌酸激酶(CK)含量及骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平，并观察骨骼肌普通及超微病理学改变。结果：与运动对照组相比，姜黄素干预明显抑制了游泳运动导致的小鼠血清CK水平的上升(P<0.01)，减轻了运动导致的骨骼肌普通及超微病理结构异常。姜黄素干预显著抑制了运动导致的小鼠骨骼肌GSH水平的下降(P<0.05)，同时拮抗了ROS和MDA含量水平的上升(P<0.01)。结论：姜黄素对小鼠急性游泳训练导致的骨骼肌损伤具有明显的抗氧化保护作用。

姜黄素；急性游泳训练；氧化应激；超微病理

研究发现，在大强度运动、训练诱发肌肉损伤的机制方面，活性氧(ROS)介导的氧化应激可能发挥关键作用[1-2]。机体在大强度运动时，ROS大量产生，细胞抗氧化和氧化平衡被打破，氧化应激水平增加，细胞膜和线粒体膜受到ROS攻击，其通透性、流动性改变，线粒体的氧化磷酸化解偶联水平增加，进一步抑制ATP合成，细胞动作电位也发生改变，最终影响骨骼肌细胞的生理功能，导致肌肉发生过劳性损伤[3-5]。因此，寻找天然、安全的拮抗运动劳损的抗氧化营养补剂，及时、有效地清除急性运动过程中骨骼肌过多产生的自由基，对于预防运动过劳性肌肉损伤、保障训练效果越发关键[6-7]。姜黄素可作为高效的抗氧化剂清除体内自由基，同时具有很好的抗炎、抗肿瘤、调节糖脂代谢以及免疫等多种生物学活性[8-9]。本研究建立小鼠急性游泳训练损伤模型，评价姜黄素对游泳运动骨骼肌损伤的保护效应，为天然植物化合物应用于抗运动劳损营养补充剂的研发提供支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性BALB/C清洁级小鼠，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，5w龄，体重18～20 g，共计40只。小鼠饲养于实验室清洁级动物房，自由饮食，动物室温度20±2 ℃，相对湿度50%±5%。

1.2 实验仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 BS-200全自动生化分析仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；5804-R低温高速离心机，德国Eppendorf公司；Spectra Max M2 酶标仪，美国Molecular Devices公司。

1.2.2 主要试剂 肌酸激酶(CK)试剂盒，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；姜黄素、DTNB、TBA、GSH、TTOP等试剂，美国Sigma公司；DHE荧光探针，碧云天生物技术公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的建立 经适应性喂养1w后，40只成年雄性BALB/c小鼠，随机分为安静对照组(Ct)、运动对照组(Ex)、运动+姜黄素100 mg/(kg·d)组(Ex+Cur)和安静+姜黄素100 mg/(kg·d)组(Cur)，每组10只。姜黄素以灌胃方式进行干预，而安静对照组和运动对照组则灌胃以等量的生理盐水，干预期为4w，干预期最后1w同时进行游泳运动训练，水温控制在30±1℃，水深45 cm，进行连续7d无负重游泳训练，每天持续90min。

1.3.2 取材及样品制备 小鼠最后1d游泳结束后，摘眼球取血并分离血清，测定血清CK含量。迅速切取骨四头肌组织块后立即于4%的中性多聚甲醛溶液中固定，准备制作石蜡切片；取各组股四头肌1 mm3左右放在2.5%戊二醛中4℃固定，进行电镜样品制备。另取股四头肌制备10%的匀浆液，离心(3 000r/min、10 min、4℃)，取上清液，测定GSH、MDA含量和SOD活性。

1.3.3 指标测定 血清CK由BS-200全自动生化分析仪检测、GSHDTNB改良比色法、SOD按照南京建成试剂盒说明书进行测定、MDA采用TBA比色法、ROS采用冰冻切片孵育DHE荧光探针法。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 姜黄素对游泳运动小鼠血清CK水平的影响

如图1所示，游泳训练导致小鼠血清中CK水平显著升高(P<0.01)，而姜黄素干预显著降低了运动组小鼠血清CK水平(P<0.01)。姜黄素自身对安静小鼠血清CK含量未见明显影响(P>0.05)。

图1 姜黄素对运动小鼠血清CK水平的影响注：**P<0.01vs安静对照组、##P<0.01vs运动对照组

2.2 姜黄素对游泳运动小鼠骨骼肌病理形态学的影响

图2光镜下H&E染色显示，安静组小鼠肌纤维排列均匀、整齐，细胞核分布均匀。运动对照组肌纤维出现广泛肿胀、扭曲、断裂和破坏，肌纤维细胞核分布不均匀，出现轻微核聚集现象。运动+姜黄素组肌纤维排列大致整齐，细胞核分布较均匀，部分肌纤维出现扭曲、断裂，但较运动对照组轻微。

本研究通过使用透射电子显微镜进一步观察姜黄素对运动小鼠骨骼肌超微病理损伤的保护效应。由图3可知，安静对照组小鼠骨骼肌细胞肌纤维排列整齐、结构完好，线粒体大小正常、外膜完整、嵴清晰。运动对照组小鼠骨骼肌细胞表现为损伤的、紊乱和不规则的肌纤维，以及低电子密度基质、严重的水肿变形、嵴损毁或溶解等线粒体超微结构的变化。而姜黄素干预小鼠则表现出肌纤维的局部紊乱以及线粒体的轻度肿胀变形，与运动对照小鼠相比，其超微结构损伤明显较轻。姜黄素本身对安静小鼠骨骼肌超微结构没有明显影响。

图2 光镜下观察姜黄素对运动小鼠骨骼肌病理改变的影响(H&E染色，×400)

图3 电镜下观察姜黄素对运动小鼠骨骼肌超微病理改变的影响

2.3 姜黄素对游泳运动小鼠骨骼肌抗氧化防御系统的影响

如图4所示，运动对照组小鼠骨骼肌GSH含量较安静对照组降低24.5%(P<0.01)，姜黄素干预显著减轻了游泳运动引发的骨骼肌GSH水平的下降幅度(P<0.05)。从图5可以看出，与安静组小鼠相比，游泳运动使骨骼肌SOD活性增加了15.7%(P<0.05)，与运动组小鼠相比，姜黄素干预组小鼠SOD活力没有显著差异(P>0.05)。此外，姜黄素自身对骨骼肌的GSH水平和SOD活力未见明显影响(P>0.05)。

图5 姜黄素对运动小鼠骨骼肌SOD活性的影响注：*P<0.05vs安静对照组

2.4 姜黄素对游泳运动小鼠骨骼肌氧化应激水平的影响

如图6所示，与安静对照组相比，运动组骨骼肌ROS的生成和MDA的含量分别增加了55.8%(P<0.01)和28.2%(P<0.01)。与运动对照组相比，姜黄素干预使得骨骼肌ROS和MDA水平分别下降了10.0%(P<0.01)和11.6%(P<0.05)。与安静对照组相比，姜黄素自身对骨骼肌ROS生成以及MDA含量没有显著影响(P>0.05)。

图6 姜黄素对运动小鼠骨骼肌ROS水平的影响注：**P<0.01vs安静对照组、##P<0.01vs运动对照组

图7 姜黄素对运动小鼠骨骼肌MDA水平的影响 注：*、**P<0.05、P<0.01vs安静对照组；#P<0.05vs运动对照组

3 讨论

长期接受大强度运动训练的军事人员和运动员等人群作为过劳性损伤的高发群体，其身体健康和正常的体能、军事训练都可能受到严重影响[5]。本研究表明，1w的游泳训练导致了小鼠骨骼肌氧化损伤，而姜黄素发挥了良好的抗氧化保护作用。

正常情况下，血清CK活性较低，当由于各种原因(肌肉萎缩、大量自由基攻击等)引起肌肉细胞膜通透性增加或者细胞坏死时会大量释放入血，常被认为是肌肉损伤的重要标志。本研究显示，游泳运动组小鼠血清CK水平显著上升，表明急性运动导致小鼠骨骼肌细胞损伤使得CK大量释放入血液。与运动对照组相比，姜黄素干预小鼠血清CK含量明显降低，提示姜黄素对游泳导致的肌细胞损伤发挥了明显的拮抗效应。Davis[10]等研究发现，下坡跑运动导致小鼠血清CK水平增加和比目鱼肌损伤，而姜黄素干预明显抑制了血清CK的上升幅度。此外，本研究中，H&E染色及超微病理学检查也显示出，姜黄素干预明显减轻了游泳运动导致的小鼠骨骼肌纤维和线粒体的超微结构紊乱或异常。

研究发现，持续的、大强度的运动或者训练，导致机体生成过量的自由基，可能是诱发骨骼肌、心肌等组织损伤的关键因素[11-12]。本研究显示，游泳运动小鼠骨骼肌的ROS和MDA含量增加，提示游泳后肌细胞受到大量自由基攻击，细胞脂质过氧化水平升高，同时，GSH也因拮抗肌细胞自由基反应的增强而出现明显消耗，其抗氧化能力显著减弱，间接揭示了骨骼肌氧化损伤的加重。游泳小鼠骨骼肌SOD活力上升，可能是由于游泳产生的活性氧刺激以及相对应的机体反馈调节。研究表明，运动过程中肌细胞缺氧时，ATP产生的数量与速率降低，供能不足，胞浆内AMP、次黄嘌呤等产物大量累积，线粒体膜功能受损，大量产生ROS[13-14]，同时，SOD、GSH-Px等抗氧化酶严重消耗。当肌细胞再次供氧时，次黄嘌呤氧化系统等方式生成过多自由基，使肌细胞的DNA、蛋白质、脂质等受到直接攻击，引发细胞膜以及线粒体和溶酶体的膜功能受损、胞浆Ca2+堆积等一系列的功能紊乱以及细胞超微结构损伤[5，15-16]。

本研究中，姜黄素干预小鼠骨骼肌的ROS和MDA水平较运动对照组均有明显降低，而GSH含量与运动对照组相比有所增加，表明姜黄素发挥了良好的抗氧化作用。Kawanishi[17]等研究也发现，小鼠-15%坡度、22 m/min速度、150 min的下坡跑运动运动模型中，姜黄素有效抑制了小鼠肌肉过氧化氢浓度和NADPH-oxidase mRNA表达的增高。Takahashi[18]等发现，在65% VO2max、60min的跑台运动中，姜黄素增加了血液中的抗氧化能力，降低了运动导致的人体活性氧代谢产物的血清衍生物的上调。研究表明，姜黄素结构中富含酚羟基，可通过直接捕捉自由基、抑制氧化酶系、激活和保护抗氧化酶系、螯合金属离子等方式，清除自由基，保护细胞膜结构和功能，减轻细胞损伤[19-20]。此外，姜黄素还可通过影响Nrf2、NF-kappaB等多种信号调控通路对细胞发挥抗氧化、抗炎等保护效应，其机制有待深入研究[21-22]。

本研究表明，姜黄素对1w的游泳训练小鼠骨骼肌损伤发挥了明显的抗氧化保护作用，为姜黄素拮抗急性运动导致的肌肉损伤提供实验支持。◇

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(责任编辑 李婷婷)

Protective Effects of Curcumin on Intense Swimming Training Skeletal Muscle Damage in Mice

GAO Chao，LIU Yang，ZHAO Jia，ZHANG Xue-song，WANG Yu-fei，YANG Yue-xin

(National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China)

ObjectiveTo investigate protective effect of curcumin against intense swimming training-induced skeletal muscle damage.MethodAdult male BALB/C mice were randomly divided into 4 groups including rested controls，intense exercise，exercise + curcumin (100 mg/kg BW)and rested plus curcumin (100 mg/kg BW)supplementation. Curcumin was administrated for 4 weeks and exercise program (swimming for 90 min/d)was performed concurrently at the fourth week. Immediately upon final exercise，the mice were sacrificed. Serum creatine kinase and skeletal muscle ultrastructural malformation were examined.SOD，GSH，ROS，and MDA of skeletal muscle were analyzed.ResultCompared to exercise group，curcumin treatment declined intense swinmming-triggered the leakage of creatine kinase (P<0.01)and skeletal muscle ultrastructural malformation. Curcumin pretreatment evidently alleviated oxidative stress by inhibiting glutathione depletion (P<0.05)，ROS over-generation (P<0.01)，and lipid peroxidation in skeletal muscle of intense exercise mice (P<0.01).ConclusionCurcumin exhibited antioxidative protective role in intense exercise-induced injuries of skeletal muscle.

curcumin；intense swimming training；oxidative stress；ultrastructural pathology

国家科技支撑计划(项目编号：2012BAD33B01)；中国疾病预防控制中心营养与健康所青年科学基金(项目编号：NINH201606)；中国科协青年人才托举工程(项目编号：YESS20160164)。

高 超(1986— )，男，博士，助理研究员，研究方向：营养与健康。

杨月欣(1955— )，女，研究员，研究方向：营养与健康。