血清中尿酸和尿素含量测定的超高效液相色谱-单四级杆质谱法国际比对＊

石莲花，金有训，何海红，全灿，徐蓓，李红梅

(中国计量科学研究院，北京 100029)

血清中尿酸和尿素含量测定的超高效液相色谱-单四级杆质谱法国际比对＊

石莲花，金有训，何海红，全灿，徐蓓，李红梅

(中国计量科学研究院，北京 100029)

基于单四极杆质谱建立了血清中尿酸、尿素含量准确测定的同位素稀释超高效液相色谱-质谱方法，并以该方法参加了国际物质量咨询委员会(CCQM)组织的“血清中尿酸尿素含量测定”的K、P国际比对。血清样品用乙腈除去蛋白质，分别采用C18反相柱和电喷雾(ESI)负离子模式检测尿酸、CN正相柱和ESI正离子模式检测尿素，同位素稀释的单点校准法进行定量，用3种标准物质(GBW 09157，GBW 09169，NIST SRM 909c)进行方法验证，测量比对血清样品(Ⅰ，Ⅱ)获得国际等效一致性。该方法操作简单、快速准确，适用于血清中尿酸尿素的定量分析。

单四级杆质谱；同位素稀释液相色谱-质谱法；尿酸；尿素；血清；国际比对

AbstractThe method to determine uric acid and urea in serum was established by single quadrupole-based isotope dilution ultra performance liquid chromatography-mass spectrometer, which was used for CCQM-K and P international comparison. Acetonitrile was added in the sample for protein precipitation, a C18reversed-phase column and electrospray ionization (ESI) negative ion mode was used to determine uric acid, and CN normal-phase column and ESI positive ion mode were used to determine urea, and a single point calibration method for quantitative isotope dilution. This method was veri fied with GBW 09157, GBW 09169 and NIST SRM 909c certi fied reference materials, and serum samples (Ⅰ，Ⅱ)were measured to obtain international equivalent consistency. The method is simple in operation, rapid and accurate, it is suitable for quantitative analysis of urea in serum uric acid.

Keywordssingle quadrupole mass spectrometry; isotope dilution high performance liquid chromatography-mass spectrometry; uric acid; urea; serum; international comparison

血清尿酸、尿素是医学临床检查肾功能的重要指标［1］。尿酸是嘌呤代谢物的最终产物，其在血清中的浓度若超过正常值则会引起痛风、肾结石、冠心病等疾病［2-4］；尿素是蛋白质代谢产物，是蛋白质代谢与尿毒症临床诊断的重要指标之一［5］。因此血清尿酸、尿素的准确定量对临床诊断及治疗具有重要意义。

目前血清尿酸、尿素的测定方法［6-8］中，质谱技术因具有快速、准确、灵敏度高等优点而得以广泛应用，其中同位素稀释液相色谱-串联质谱联用(LC-IDMS/MS)［9-12］、气相色谱 - 质谱 (GC-ID/MS)［13-15］技术，是国际检验医学溯源联合委员会(JCTLM)认可的参考测量方法。近年来，质谱技术发展迅速，一级和二级质谱性能进一步提升，分辨率和灵敏度、特异性都有了显著提高。本研究结合同位素稀释技术，建立了操作简便、特异性强、灵敏度高的液相色谱-单四级杆质谱(LC-IDMS)法，可代替前处理繁琐的气相色谱-质谱法(GC-MS)和易被高浓度待测物污染的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。用此方法参加国际物质量咨询委员会组织的K，P国际比对，使用中国计量科学研究院的纯物质标准物质和血清基体标准物质进行了校准和方法验证，使比对结果的量值溯源到中国计量科学研究院，保证了测量结果的准确、可靠，实现了我国与国际尿酸和尿素参考系统的互认。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪：ACQUITY™UPLC/SQD型，美国Waters公司；

分析天平：XP10003S型(感量为1 mg)，XP205型(感量为0.01 mg)，XP26型(感量为0.001 mg)，瑞士梅特勒-托利多公司；

混合器：VORTEX GENIE 2型，美国Scienti fic Industries公司；

多用途旋转摇床：ROTO-SHAKE GENIE型，美国SI公司；

移 液器：10～100 μL，20～200 μL，100～1 000 μL，0.5～5 mL，德国 Eppendorf公司；

氮吹仪：N-EVAP112型，美国OA-SYS公司；

离心机：Sigma 3K15型，美国Sigma公司；

过滤膜：0.22 µm，亲水性聚丙烯膜，美国Pall公司；

尿酸纯度标准物质：编号为GBW 09202，纯度为99.8%，中国计量科学研究院；

尿酸同位素标记物：1，3-15N2，纯度为 98%，美国剑桥同位素实验室；

尿素纯度标准物质：编号为GBW 09201，纯度为99.8%，中国计量科学研究院；

尿素同位素标记物：Urea-13C，15N2，纯度不小于98%，13C含量为99%，15N含量为98%，美国剑桥同位素实验室；

冰冻人血清中尿素标准物质：编号分别为GBW 09157，GBW 09169，中国计量科学研究院；

冰冻人血清中尿素标准物质：编号为NIST 909C，美国国家标准与技术研究院；

比对血清样品：编号分别为I和II，均为1 mL，于-70℃冰箱中保存，新加坡卫生科学局；

乙酸铵：色谱纯，美国Sigma公司；

氨水：色谱纯，中国阿拉丁公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merk公司；

甲酸：色谱纯，德国Merk公司；

实验用水为超纯水，由美国Mililpore公司超纯水仪制得。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

(1)测定尿酸的色谱条件。

色谱柱：BEH C18柱 (150 mm×2.1 mm，1.7µm，美国Waters公司)；柱温：37℃；进样体积：5µL ；流动相：A 为 10 mmol/L 乙酰胺溶液 (pH 4.6)，B 为乙腈，梯度洗脱，0～4.5 min 100% A，4.5～5.5 min A由100%变化至20%，5.5～7.5 min保持20%A，7.5～8 min A由20%变化至100%且保持至12.5 min；流量：0.2 mL/min。

(2)测定尿素的色谱条件。

色谱柱：ZORBAX SB-CN柱 (250 mm×4.6 mm，5 µm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：37℃；进样体积：5 µL；流动相：0.1%甲酸水溶液-甲醇(体积比为1∶1)；等梯度洗脱。

1.2.2 质谱条件

(1)测定尿酸的质谱条件。

采用电喷雾离子源(ESI)负离子模式；离子源温度：150℃；脱溶液温度：450℃；脱溶剂：N2，流量为 550 L/h；锥孔气：N2，流量为 50 L/h；毛细管电压：2.2 kV ；监测离子(m/z)：167.1，169.1。

(2)测定尿素的质谱条件。

采用电喷雾离子源(ESI)正离子模式；离子源温度：150℃；脱溶液温度：450℃；脱溶剂：N2，流量为 550 L/h；锥孔气：N2，流量为 50 L/h；毛细管电压：3.0 kV ；监测离子(m/z)：61.1，64.1。

1.3 实验方法

1.3.1 样品准备

测定两份比对血清样品中尿酸、尿素的含量。测定时每瓶比对样品取0.2 mL，进行样品前处理。

1.3.2 尿酸、尿素标准溶液配制与样品前处理

准确称取一定质量的尿酸纯度标准物质，用1 mmol/L 氨水溶液稀释至 100 μg/g，制得尿酸标准储备液，置于摇床混合仪中充分溶解。以同样步骤制备［15N2］尿酸标记储备液(100 μg/g)。各取一定量尿酸标准储备液、［15N2］尿酸标记储备液，用10 mol/L乙酰胺流动相溶液制备尿酸校准混合溶液，其中尿酸和［15N2］尿酸含量比约为1∶1，尿酸校准混合溶液中尿酸的浓度尽量接近于血清尿酸含量。

血清样品于室温下平衡2 h，取0.2 mL并精确称量，加入［15N2］尿酸标记物使尿酸标记物含量与血清尿酸含量比接近与1∶1，摇匀。然后加入约4倍体积的乙腈，振荡混匀，再置于4℃离心机中以8 000 r/min的转速离心15 min。取上清液，用45℃氮气吹干，加入流动相复溶至10 μg/g，用0.22μm过滤膜过滤，进行LC-IDMS分析。

以相同步骤用水稀释制备400 μg/g尿素和［13C，15N2］尿素标记储备液、尿素校准混合溶液、血清前处理样品。

尿酸及尿素监测离子色谱图如图1所示。为了确保血清中尿酸、尿素含量测定结果的准确性，以冰冻人血清中尿素、尿酸标准物质进行方法验证。

图1 比对血清I离子色谱图

2 结果与讨论

2.1 结果计算

使用同位素稀释单点校准法计算血清中尿酸或尿素(待测物)含量按下式：

式中：c——血清样品中待测物含量，mg/kg；

cs——校准混合溶液中待测物含量，mg/kg；

Ms——校准混合溶液中加入的待测物质量，mg；

Rx——血清样品中待测物与标记待测物峰面积比；

Mix——血清样品中加入的标记待测物质量，mg；

Mis——校准混合溶液中加入的标记待测物质量，mg；

Rs——校准混合溶液中待测物与标记待测物峰面积比；

Wx——血清样品质量，mg。

2.2 方法验证

用建立的LC-IDMS法测定尿酸、尿素基体标准物质，以评价方法的准确性，测定结果见表1。由表1可知，基体标准物质的测量值均在证书标准值不确定度范围内。

表1 基体标准物质LC-IDMS法测定结果 mg/kg

2.3 比对样品测定结果

按照校准混合溶液、样品1、样品2顺序循环进样5次，利用单点校准法计算血清中尿酸、尿素含量，测量结果及不确定度评定结果分别见表2、表3。

表2 比对血清样品Ⅰ、Ⅱ中尿酸含量及不确定度

表3 比对血清样品I、II中尿素含量及不确定度

2.4 参与国间的比对结果

本次比对有两种不同浓度尿酸、尿素血清(Ⅰ、Ⅱ样)，共有15个国家计量院参加。此比对使用的标准物质及测定方法见表4。由表4可知，大部分参与国使用了美国国家标准与技术研究院提供的标准物质和 LC-IDMS/MS、GC-ID/MS测定方法，而本研究则使用自制的标准物质和LC-IDMS方法。结果 IDMS(LC/MS、LC/MS/MS、GC/MS)法测定尿酸的平均值为(136.4±0.93) mg/kg (Ⅰ 样)，(39.37±0.15) mg/kg (Ⅱ 样)；尿素的平均值为(1 486.20±8.67) mg/kg (Ⅰ样)，(334.50±1.29) mg/kg (Ⅱ样)。对比表 2、表 3 可以看出，中国计量科学研究院的比对结果与同法测量平均值接近，从而验证了LC-IDMS测量方法的准确性和可靠性。

表4 比对参与国家采用的标准物质及测定方法统计

3 结论

本次比对重点是解决尿酸的难溶解性和尿素的高效分离。尿酸一般不溶于水和有机溶剂，溶于KOH，NaOH和氨水等碱性溶液和酸性缓冲溶液。而目前尿酸参考测量方法使用氨水，其浓度会影响尿酸的稳定性［16］。本方法采用1 mmol/L氨水充分溶解尿酸(≥1 h)，且使用超高效色谱柱和乙酰胺缓冲溶液提高尿酸的分离效果及离子化效率。对于不易用C18反相色谱柱直接分离、易受质谱干扰离子(质荷比＜100)影响的尿素，则采用正相色谱技术高效分离，并结合高分辨率单四级杆质谱准确定量。此方法样品前处理简便，与中国计量科学研究院和美国国家标准与技术研究院提供的标准物质标准值之间的相对偏差小于0.8%，可以准确测定血清中尿酸尿素含量。国际物质量咨询委员会组织的血清尿酸、尿素(K，P)国际比对获得了良好的结果，保证了中国计量科学研究院尿酸和尿素检测领域的量值溯源。

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首个国产检测仪器设备验证与综合评价行业标准发布

第五届“国产检测仪器设备验证与综合评价技术服务推介会”正式发布了《分析化学仪器设备验证与综合评价指南》行业标准。该标准系首个国产检测仪器设备验证与综合评价认证认可行业标准，将于2017年12月1日起正式实施。

此项行业标准是北京市科学技术委员会与北京市质量技术监督局在验评项目工作基础上，由北京出入境检验检疫局牵头与北京海光仪器有限公司共同将组织工作上升为行业标准，概括性定义了国产检测仪器验证与综合评价的组织结构、流程，确定了各个阶段的实施步骤，形成了具有系统性、规范性、科学性的，适用于国产检测仪器验证与综合评价工作的指导性文件。

(李)

Determination of Uric Acid and Urea in Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Single Quadrupole Mass Spectrometry for International Comparison

Shi Lianhua, JinYouxun, He Haihong, Quan Can, Xu Bei, Li Hongmei
(National Institute of Metrology, Beijing 100029, China)

O657.7

A

1008-6145(2017)03-0085-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2017.03.022

*国家科技基础专项(2011FY130100)；国家重点研发计划项目(2016YFD0500800)；中国计量科学研究院比对专项(03-AJLSF15)

联系人：石莲花；E-mail: shilh@nim.ac.cn

2017-04-01