反相液相色谱法测定苦参中苦参碱和氧化苦参碱

郝文，李丹丹，杨超

(青岛市疾病预防控制中心， 青岛市预防医学研究院，青岛 266033)

反相液相色谱法测定苦参中苦参碱和氧化苦参碱

郝文，李丹丹，杨超

(青岛市疾病预防控制中心， 青岛市预防医学研究院，青岛 266033)

建立反相液相色谱法测定苦参中苦参碱和氧化苦参碱含量的方法。提取溶剂为乙醇，选择C18色谱柱，以甲醇-水-三乙胺溶液(55∶45∶0.2)为流动相，流量为0.8 mL/min，紫外检测器波长为210 nm。苦参碱和氧化苦参碱的质量浓度在10～200 mg/L范围内均与其色谱峰面积呈良好的线性，线性相关系数均大于0.999，检出限分别为0.05， 0.1 mg/L。苦参碱和氧化苦参碱的加标回收率分别为98.47%，97.89%，测定结果的相对标准偏差分别为1.32%，1.08%(n=6)。该方法操作简便，干扰少，灵敏度高。

反相液相色谱法；苦参；苦参碱；氧化苦参碱

AbstractA method for the determination of matrine and oxymatrine in sophora flavescens by reversed phase liquid chromatography was established. The extraction solvent was ethanol， C18column was selected， methanol-water-three ethylamine solution (55∶45∶0.2) was used as the mobile phase with the flow rate of 0.8 mL/min，and the UV detector wavelength was 210 nm. The concentration of matrine and oxymatrine was linear with its chromatographic peak area in the range of 10-200 mg/L，the linear correlation coef ficients were more than 0.999, and the detection limits were 0.05,0.1 mg/L, respectively. The recovery rates of matrine and oxymatrine were 98.47%, 97.89%，and the relative standard deviations of determination results were 1.32% and 1.08%(n=6), respectively. The method has the advantages of simple operation， less interference and high sensibility.

Keywordsreversed phase liquid chromatography; sophora flavescens; matrine; oxymatrine

苦参是豆科槐属类植物的根，其含有的活性成分主要是苦参碱和氧化苦参碱，是一种具有喹喏里西啶骨架的生物碱［1］。苦参碱和氧化苦参减具有抗病毒、消炎止痛和抗肿瘤的功效，它在人体内作用机理是在中枢神经系统、心血管系统具有抗病毒、抗炎免疫、升高白细胞、激活细胞膜腺苷酸环化酶以及清除体内自由基等作用，在医学、药学等临床上的应用越来越广泛［2］。

测定苦参碱和氧化苦参碱常用分光光度法［3］、酸碱滴定法［4］、毛细管电泳法［5］，这些方法存在样品前处理繁琐、消耗时间长等缺点。液相色谱法在这方面的研究近年来开始报道，白小红等采用液相微萃取/后萃取-高效液相色谱法测定氧化苦参碱和苦参碱，具有溶剂用量小、干扰少等优点［6］；Fukuda等采用质谱方法对不同苦参碱类组分进行了检测和鉴别［7］。笔者采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)同时测定苦参粗提取液中的苦参碱和氧化苦参碱含量，该方法具有样品前处理简单，定量准确，简便快速的特点。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260型，美国安捷伦科技有限公司；

DAD紫外检测器：G1314A型，美国安捷伦科技有限公司；

电子分析天平：BSA224S型，德国赛多利斯公司；

超声波脱气机：KQ2200E型，昆山超声仪器公司；

容积过滤器：T-50型，北京兴延诚博科技有限公司；

纯水机：Ultra Clear TWF型，德国西门子公司；

甲醇：色谱纯，德国Merck公司；

无水乙醇：分析纯，国药试剂化学试剂厂；

中性氧化铝：粒径为75 μm(200目)，Ⅳ级活度；

苦参碱和氧化苦参碱对照品：中国药品生物制品研究所；

实验用水为纯水机制得一级水。

1.2 样品前处理

将待测样品切成小块（约1 g），切碎，置于150 mL烧杯中，加入50 mL乙醇，使得样品分散均匀，使用组织捣碎机捣碎2 min，用快速滤纸过滤，收集滤液，再用50 mL滤液分多次洗涤滤纸上残渣，收集合并滤液于旋蒸瓶中，于50℃蒸干。准确加入10.00 mL流动相溶解样品，混匀，过0.45 μm微孔滤膜，供检测［8］。

1.3 对照品储备溶液制备

称取苦参碱和氧化苦参碱对照品各50.00 mg，置于5 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容至标线，摇匀，所制备的对照品储备溶液质量浓度为 10.00 mg/mL，置于 4℃冰箱中备用［9］。

1.4 仪器工作条件

色 谱 柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水-三乙胺(55∶45∶0.2)，加入磷酸溶液调节流动相pH值为2.0［10-11］，流量为 0.8 mL/min ；紫外检测器波长：210 nm；柱温：35℃，进样体积：10μL；外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂

分别采用乙醇、甲醇-水(1∶1)作为提取溶剂进行试验，结果表明，用甲醇-水(1∶1)作为提取溶剂时，滤液浑浊，杂质较多，需进一步净化处理，否则影响液相分析；用乙醇作为提取溶剂，滤液澄清，可浓缩蒸干定容后直接进样，因此实验选择乙醇为样品提取溶剂。

2.2 流动相及其流速

分别采用不同比例的甲醇-水、乙腈-水作为流动相进行试验，结果表明，以乙腈-水作为流动相时，加入基体改进剂后峰型改善不明显，分离效果不好；以甲醇-水为流动相时，发现色谱峰不对称，有较严重的拖尾现象，加入0.2%的乙二胺后，峰型得到很好改善，苦参碱和氧化苦参碱能较好地分离，分离度在1.5以上。因此实验选择甲醇-水-三乙胺溶液(55∶45∶0.2)为流动相。

考察了流动相流量分别为 0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL/min时，苦参碱和氧化苦参碱的分离情况。试验结果表明，流动相流量过高色谱峰过于拥挤，分离效果差；而流动相流量过低，分析时间延长，色谱峰型也变差，最终选择流动相流量为0.8 mL/min。在此条件下，100 mg/L的苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液的色谱峰见图1。

图1 苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液色谱图

2.3 标准工作曲线绘制

分别移取适量苦参碱和氧化苦参碱对照品储备溶液于50 mL容量瓶中，用流动相稀释至标线，分别配制苦参碱和氧化苦参碱的质量浓度为10，20，50，100，200 mg/L 的系列标准工作溶液。在1.4条件下分别进样分析。以待测物的质量浓度X(mg/L)为横坐标，以对应的色谱峰面积Y为纵坐标进行线性回归，分别得到苦参碱的回归方程为Y=29.210 2X-4.8763，r=0.999 8，线性范围为 10～200 mg/L；氧化苦参碱的回归方程为Y=22.660 7X-3.111 5，r=0.999 9，线性范围为 10～200 mg/L。

2.4 检出限和定量限

逐级稀释苦参碱和氧化苦参碱对照品储备溶液，直至各自响应信号为噪声10倍和3倍，分别记下此时溶液浓度，即取S/N=3时响应值对应的浓度为检出限，S/N=10时响应值对应的浓度为定量限。最后得出苦参碱的检出限为0.05 mg/L，定量限为0.2 mg/L；氧化苦参碱检出限为0.1 mg/L，定量限为0.4 mg/L。

2.5 精密度试验

在1.4仪器工作条件下对50 mg/L的苦参碱和氧化苦参碱标准使用液进行6次重复测定，结果见表1。由表1可知，苦参碱测定结果的相对标准偏差为1.32%，氧化苦参碱测定结果的相对标准偏差为1.08%。

表1 精密度试验结果(n=6)

2.6 稳定性试验

取适量苦参样品，按1.2方法进行提取，在1.4条件下分别在 0，2，4，6，8，12，24 h 测定苦参碱和氧化苦参碱的含量，测定结果见表2。由表2可知，苦参碱和氧化苦参碱含量在24 h内变动较小，7次测定结果的相对标准偏差分别为5.16%，1.60%，可见稳定性较好。

表2 不同时间苦参碱和氧化苦参碱检测结果

2.7 加标回收试验

对某苦参样品按1.2方法提取后，在1.4仪器条下测定，然后分别加入一定量的对照品溶液进行加标回收试验，苦参碱和氧化苦参碱的回收率分别见表 3、表 4。

表3 苦参碱回收试验结果(n=6)

表4 氧化苦参碱回收试验结果(n=6)

由表3、表4可知，苦参碱和氧化苦参碱的平均加标回收率分别为98.47%，97.89%，可见方法的准确度较高，满足方法学要求。

2.8 样品检测

从不同药店购到5份不同品牌的苦参药材样品，按1.2方法提取后进行测定，苦参碱和氧化苦参碱含量见表5。由表5可以看出，不同地区生产的苦参药材样品中，苦参碱和氧化苦参碱含量不同，来自福康大药房产自陕西咸阳地区的苦参碱和氧化苦参碱含量最高。

表5 苦参样品检测结果

3 结语

建立了反相液相色谱法同时检测苦参中苦参碱和氧化苦参碱的含量，以甲醇-水-三乙胺溶液(体积比55∶45∶0.2)为流动相，分离度好。该方法操作简单，干扰少，检出限低，测定结果的精密度和准确度较高，可以在中药生产加工企业进行应用和推广。

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Determination of Matrine and Oxymatrine in Sophora Flavescens by Reverse Phase Liquid Chromatography

Hao Wen， Li Dandan， Yang Chao
(Qingdao City Center for Disease Control and Prevention, Qingdao Institute of Preventive Medicine, Qingdao 266033, China)

O657.7

A

1008-6145(2017)04-0068-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2017.04.017

联系人：郝文； E-mail: 645412635@qq.com

2017-04-12