祛风及开窍类引经药对六味地黄丸有效成分眼内分布的影响

白昱旸，陈强，梁丽娜，李雪丽，梁洁，马群英

·论著：实验研究·

祛风及开窍类引经药对六味地黄丸有效成分眼内分布的影响

白昱旸1,2，陈强1，梁丽娜1，李雪丽1，梁洁1，马群英1

目的观察祛风及开窍类引经药柴胡、防风及冰片对六味地黄丸有效成分在眼不同组织分布和代谢的影响，探讨引经药是否可以增加药物有效成分在眼部的靶向性聚集。方法将252只家兔随机分为6组，每组42只，对照组正常饲养不作处理，其它组分别用蒸馏水、六味地黄丸、六味地黄丸+防风、六味地黄丸+柴胡、六味地黄丸+冰片溶液灌胃，在灌胃后0.25、0.50、0.75、1.00、2.00、4.00、8.00 h各时间点每组随机取6只家兔，采用液质联用技术检测房水、玻璃体、视网膜中莫诺苷和马钱苷的含量，比较各组含量差异。结果房水中检测发现莫诺苷、马钱苷的浓度曲线变化趋势较一致，均在灌胃后0.25~1 h达到峰值，在8 h后基本清除完全，其中六味地黄丸+冰片组的马钱苷、莫诺苷的浓度在0.25~0.75 h均较六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组高，差异有统计学意义（P<0.05）。各组有效成分在玻璃体中的浓度均很低，马钱苷的曲线呈波动趋势，各个时间点各组两两比较差异均无统计学意义（P>0.05），莫诺苷的曲线在0.25~1 h达到峰值，随后在8 h基本清除完全，其中六味地黄丸+冰片组的莫诺苷浓度在0.25~0.75 h均较六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组高，差异有统计学意义（P<0.05）；其它各组两两比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。各组视网膜内莫诺苷和马钱苷的浓度也偏低，其中六味地黄丸+冰片组马钱苷和莫诺苷的浓度在0.25 h较六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组高，差异有统计学意义（P<0.05）；其他组两两比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论冰片可以增加六味地黄丸有效成分在房水、玻璃体和视网膜的浓度，这可能是引经药的作用机制之一。

引经药；六味地黄丸；有效成分；眼；分布

内治法是中医眼科的重要治疗手段，眼位至高，组织精细，结构复杂，在治疗上药力不易到达病所，故引经理论在眼科受到临床医家广泛重视。关于中药引经的原理，尤在泾在《医学读书》中说：“兵无向导则不达贼境，药无引使则不通病所”，但是引经药的具体作用机制尤其在眼科的相关研究既往报道较少。本文通过观察冰片、柴胡及防风对六味地黄丸有效成分在眼不同组织分布和代谢的影响，探讨引经药是否可以增加药物有效成分在眼部的靶向性聚集。

1 资料和方法

1.1 实验动物

健康清洁级新西兰兔252只，雌雄不论，8～10周龄，质量1.8~2.5 kg。裂隙灯显微镜、检眼镜检查眼前节及眼底均无异常。动物由北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂提供，许可证号：SCXK（京）2011-0006。购入后，适应性饲养1周。

1.2 实验试剂和设备

莫诺苷和马钱苷标准品均购自上海源叶生物科技有限公司，HPLC测定纯度大于98%；岩白菜素对照品(内标)，含量94.4%，购自中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯)和甲酸(色谱纯)购自北京迪马科技有限公司。Agilent6410 TripleQuadLC/MS/MS，1200 seriesHPLC，美国安捷伦科学技术公司生产；赛多利斯BT 25S天平，美国赛多利斯公司生产；英国STURAT样品浓缩仪；Milli-Q Integral 3超纯水仪，德国默克密理博公司。

1.3 样品制备

采用随机数字表法将252只新西兰兔随机分为正常对照组、蒸馏水、六味地黄丸、六味地黄丸+防风、六味地黄丸+柴胡、六味地黄丸+冰片组，对照组正常饲养不作处理，其余各组予以相应溶液灌胃，在灌胃后0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、4.0、8.0 h每一时间点每组随机选取6只家兔，采用过量麻醉法处死家兔，迅速摘除眼球，用生理盐水充分冲洗后，抽取房水，分离玻璃体、视网膜，并精密称重，玻璃体匀浆，视网膜加生理盐水0.5ml匀浆，将匀浆后的组织样品于-80℃保存。

1.4 样本处理

取视网膜、玻璃体、房水匀浆各100μL，分别加入113ng/mL岩白菜素内标溶液20μL，涡旋混匀30s，加入3.5mL乙酸乙酯，涡旋提取4min，5000 r/min离心10min，吸取上清，40℃水浴氮气吹干。残渣用100μL乙腈:水（12：88V/V）复溶,5μL进样分析。

1.5 色谱条件

色谱柱ZORBAX SB C-18，2.1×50mm，1.8μm；流动相为乙腈:水（含0.1%甲酸），等度洗脱，洗脱比例12:88（V/V）；流速0.4ml/min；柱温35℃，进样量5μL。

1.6 质谱条件

Esl离子源，负离子模式，雾化压力45 Psi，干燥气(N2)流速为10 L/min，干燥气温度为300℃，毛细管电压4000V，多离子反应监测(MRM)方式，监测离子m/z451.2→242.9(莫诺苷)、m/z435.2→227.2(马钱苷)→192岩白菜素(内标)，莫诺苷、马钱苷和内标碎裂电压分别为80 V，90 V，60 V，120 V,莫诺苷、马钱苷碰撞电压均为10 V，内标碰撞电压为15 V。

1.7 统计学处理方法

所得数据均以x¯±s表示，采用Excel 2003及SPSS 17.0软件包进行统计处理和绘图。不同组别重复测量资料的比较采用重复测量的方差分析进行检验,若不满足球形检验，则使用Greenhouse-Geisser S校正系数进行校正；在各时间点上不同组别的两两比较采用单因素方差分析，若方差齐性，用LSD法作两两比较，若方差不齐，用Dummett T3法作两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 六味地黄丸有效成分在眼不同组织分布的线性方程

血浆莫诺苷、马钱苷的检测浓度分别在1.014、0.988 ng/mL以上与峰面积呈良好线性关系（表1）；房水莫诺苷、马钱苷的检测浓度分别为2.02～259 ng/mL、1.97～253 ng/mL，与峰面积呈良好线性关系；玻璃体莫诺苷、马钱苷的检测浓度分别为在2.02～259 ng/mL、1.97～253 ng/mL，与峰面积呈良好线性关系；视网膜莫诺苷、马钱苷的检测浓度分别为2.02～518 ng/mL、1.97～506 ng/mL，与峰面积呈良好线性关系。

表1 莫诺苷及马钱苷在兔眼不同组织的线性方程

2.2 六味地黄丸有效成分在眼不同组织的含量

2.2.1 六味地黄丸有效成分在房水中的分布和代谢：在观察的7个时间点，各组莫诺苷和马钱苷含量在房水中有相应变化，两者浓度曲线的趋势较一致，六味地黄丸组及六味地黄丸+防风组的马钱苷、莫诺苷浓度在灌胃后1h达到高峰，六味地黄丸+冰片组在0.25 h即达到高峰，各组的马钱苷、莫诺苷均在8 h基本清除完全，六味地黄丸+冰片组在0.25h~0.75 h马钱苷的含量均较六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组高，差异有统计学意义(F0.25=28.933，P0.25＜0.001；F0.5=3.925，P0.5=0.036；F0.75= 7.200，P0.75=0.005)，六味地黄丸+冰片组在0.25 h~ 0.75 h莫诺苷的含量均较六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组高，差异有统计学意义(F0.25=8.202，P0.25=0.003；F0.5=4.503，P0.5=0.025；

F0.75=3.539，P0.75=0.048)，六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组两两比较，差异无统计学意义（P>0.05）。其它时间点各组比较差异无统计学意义（图1）。

图1 各组不同时间点兔房水中莫诺苷及马钱苷的含量

2.2.2 六味地黄丸有效成分在玻璃体中的分布和代谢：各组有效成分在玻璃体中的浓度均偏低，部分时间点的浓度已低于定量下限，说明药物有效成分到达玻璃体中的含量很少；另外，各组莫诺苷的含量呈波动趋势，六味地黄丸组及六味地黄丸+冰片组的马钱苷不同观察时间点出现反复的浓度下降及升高，在所观察的时间点内各组马钱苷含量差异均无统计学意义（P>0.05）。莫诺苷的浓度在0.25 h到1 h达到峰值，随后在8 h基本清除完全。其中六味地黄丸+冰片组的莫诺苷浓度在0.25~0.75 h均较六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组高，差异有统计学意义（F0.25=3.551，P0.25=0.048；F0.5= 14.353，P0.5＜0.001；F0.75=7.368，P0.75=0.005），六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组两两比较，差异无统计学意义（P>0.05）。其它时间点各组比较差异无统计学意义（图2）。

2.2.3 六味地黄丸有效成分在视网膜中的分布和代谢：莫诺苷、马钱苷在视网膜中的浓度变化趋势较一致，六味地黄丸+冰片组在灌胃后0.25 h莫诺苷、马钱苷含量达到高峰，较六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组含量明显增加，差异有统计学意义（F马钱苷=3.265，P马钱苷=0.043；F莫诺苷=3.274，P莫诺苷=0.047），其它各组两两比较差异无统计学意义（P>0.05）；随后莫诺苷、马钱苷的浓度迅速下降并趋于平缓（图3），各组之间相比，差异均无统计学意义（P>0.05）。

图2 各组不同时间点兔玻璃体中莫诺苷及马钱苷的含量

图3 各组不同时间点兔视网膜中莫诺苷及马钱苷的含量

3 讨论

评价药物在眼部的疗效首先应考虑该药能否透过眼给药屏障到达作用部位，中医眼科许多经典中药方剂已经应用于临床多年，可能由于检测方法的限制，口服给药后有效成分在眼内的浓度、血眼屏障的通过率以及如何提高通过率方面的研究鲜有报道。液相色谱-质谱联用技术是近年来发展的药物检测手段，目前已广泛应用于生物样品的分析和药代动力学研究，具有灵敏度高，特异性强，重现性好，回收率稳定等特点[1-2]。六味地黄丸是滋补肝肾的经典方剂，在眼科应用也较为广泛，尤其是视网膜退行性病变，虽然临床证型较为复杂，但肝肾不足是其常见证型，因此临床上常用六味地黄丸加减治疗。现代药理学研究表明，莫诺苷、马钱苷为六味地黄丸体内代谢的主要活性成分，具有保护脑神经的作用[3-4]。在本次实验中我们采用液相色谱-质谱联用技术观察六味地黄丸配伍引经药是否能增加莫诺苷和马钱苷在眼部的靶向性聚集。

在眼科内服方剂的引经药中，风药是最常用的，东垣《兰室秘藏·卷中头痛门》曰：“高巅之上，惟风可到，故味之薄者，阴中之阳，乃自地升天者也”；《脾胃论》曰：“肾肝之病同一治，为俱在下焦，非风药行经不可也”。除用于治疗外障眼病外，在治疗内障方中也多配伍风药，如《太平惠民和剂局方》之明睛地黄丸中之防风，李东垣的益阴肾气丸中的柴胡，倪维德之石解夜光丸的防风，傅仁宇之生熟地黄丸中的防风、羌活，根据中医理论眼位至高,内服方剂中伍用风药，取其升散之功,使药力直达病所而发挥治疗作用[5]。冰片是常用的芳香开窍药，单独较少应用，常作为引经药以增加其它药物的治疗效果，发挥“芳香走窜,引药上行”的作用[6]。古代冰片在眼科中主要用于治疗外眼病，如目赤、流泪、翳膜、痒痛、赤烂、干涩等，亦用治目昏等内障，分外用和内服，以外用为主[7]。现代药代动力学研究发现，冰片可提高家兔血眼屏障的通透性,是一种有效促进药物透过血眼屏障的穿透促进剂[8]。

我们研究结果显示各组有效成分在玻璃体及房水中的浓度均偏低，部分玻璃体药物浓度已低于定量下限，说明药物有效成分受血-视网膜屏障及血-房水屏障的影响，到达玻璃体和房水中的含量较少，相对来说在视网膜中的分布较高。给药后各组分在家兔房水、玻璃体、视网膜中呈现相似的动态变化过程，冰片对药物有效成分吸收的促进作用较大，给药0.25-0.5 h后在各组织中均达最大浓度，随后快速消除，8 h时各组分已基本清除完全，六味地黄丸+冰片组的有效成分在眼组织中含量与其它组相比差异有统计学意义，提示冰片具有较好的“引经”作用。近些年学者们对冰片的引经机制也进行了探讨，葛朝莉等[9]的研究表明，冰片对大鼠脑毛细血管内皮细胞之间的紧密连接影响显著，可使大鼠血脑屏障的超微结构发生可逆性改变。刘娜[17]发现灌胃冰片后血脑屏障（blood brain barrier,BBB）通透性增加，6小时作用最明显，伴随着血脑屏障的开放增加，羟基红花黄色素A及葛根素在脑内的浓度亦升高。赵保胜等[10]指出用冰片诱导的BBB开放与病理性BBB开放有着质的区别，其开放为生理性开放，不会引起脑的病理性损害。我们以往的研究发现冰片可以一过性影响视网膜及脉络膜claudin-5蛋白的表达[12]，claudin-5是血-视网膜屏障紧密联接的组成蛋白，对claudin-5基因抑制的结果使得血视网膜屏障有选择性、一过性及可逆性的开放，可以使分子量小于800道尔顿的药物通过血视网膜屏障从而达到治疗目的[13]。因此，冰片对药物在眼部的引经作用可能与其促使血视网膜屏障生理性开放有关。

本研究从药物代谢角度初步观察了柴胡、防风及冰片对六味地黄丸有效成分眼内分布的影响，探讨了冰片作为引经药的作用机制，为临床引经药的应用提供了一定的客观依据及理论基础，关于加用冰片后能否增强六味地黄丸对视网膜变性病理模型的保护作用需要从药效学角度进一步观察和研究。

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Effectofw ind-expelling and orifice-openingmeridian-lead-in herbson intraocular distribution ofactive ingredients from Liuwei Dihuang Pills.

BAIYuyang,CHEN Qiang,LIANG Lina,et al.
Eye Hospital,China Academy ofChineseMedicalSciences,Beijing100040,China

OBJECTIVE Toobserve the effectofwind-expellingand orifice-openingmeridian-lead-in drugon the intraocular distribution of active ingredients from Liuwei Dihuang pills,and to investigate whether meridian-lead-in drugs could increase the targeting accumulation of active ingredients in the eye.METHODSA total of 240 rabbitswererandomly divided into6 groupsevenly.Subjects in controlgroup were fed routinelywithoutany treatment,the othergroupswere administrated with distilled water,LiuweiDihuang pills,LiuweiDihuang pillsplus Bingpian,LiuweiDihuang pillsplus Fangfeng,LiuweiDihuang pillsplus Chaihu respectively by gavage.At time pointas 0.25h,0.5h,0.75h,1.0h,2.0h,4.0h,8.0h after gavage,6 rabbits randomly chosen from each group were tested for their content of Morroniside and Loganinin aqueous humor,vitreous and retina by LC-MS,and the difference between groupswas compared aswell.RESULTS In the aqueoushumor,the contentofMorroniside and Loganin shared similar trend,both reached peak at 0.25 to 1h after gavage, and were both dispelled totally 8hours after gavage.A-mong them,the contents of Morroniside and Loganin in LiuweiDihuang pills plus Bingpian at the time pointsbetween 0.25h~0.75 h were significantly higher than thatof Liuwei Dihuang pills group,Liuwei Dihuang pills plusFangfeng group,Liuwei Dihuang pills plus Chaihu group（P<0.05）.The contents of all groupswere in low level in vitreous.Loganin content varied and showed no significant difference among all the groups(P>0.05).Morroniside reached peak between 0.25 and 1h after gavage,and then was dispelled totally at 8th post gavage.The contents of Morroniside in LiuweiDihuang pills plus Bingpian group at the time points between 0.25h and 0.75h were significantly higher than that of Liuwei Dihuang pills group,Liuwei Dihuang pills plus Fangfeng group,Liuwei Dihuang pillsplusChaihu group（P<0.05）.Therewasno significantdifferencebetween other two groups in pair（P>0.05）.The contentofMorroniside and Loganin in the retinawasalso low in all groups.Among them,the content in LiuweiDihuang pills plus Bingpian group 0.25h after gavagewas significantly higher than thatof LiuweiDihuang pills group, LiuweiDihuang pills plus Fangfeng group,LiuweiDihuang pills plus Chaihu group（P<0.05）.Therewasno significantdifference in comparisonsbetween other two groups（P>0.05）.CONCLUSIONS Bingpian could increase the active ingredients of Liuwei Dihuang pills in the aqueous humor,vitreous,and retina,which might be one of the mechanismsofmeridian-lead-in drug.

meridian-lead-in drug;LiuweiDihuang pills;active ingredient;eye;distribution

R285.5；R77

A

1002-4379（2017）03-0141-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.03.001

1国家自然科学基金（81102618）

2人力资源和社会保障部“留学人员科技活动项目”作者单位：1中国中医科学院眼科医院，北京100040；

2广东省中医院眼科，广州510120

梁丽娜，Email:lianglina2001@hotmail.com