骨疏颗粒对骨质疏松大鼠骨形成和骨吸收标志物的影响

杜义斌　郭文清　严继林

摘要：目的观察骨疏颗粒对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢指标的影响。方法选择SD大鼠90只，空白对照组（假手术组）15只，手术造模组75只。造模组切除卵巢复制绝经后骨质疏松症模型。将造模成功大鼠随机分为模型组、戊酸雌二醇组、骨疏颗粒高、中、低剂量组5组，每组12只。空白对照组、模型组给予生理盐水10ml/（kg.d）灌胃；戊酸雌二醇组给予戊酸雌二醇片0.09mg/（kg.d）灌胃；骨疏颗粒高、中、低剂量组分别按照高剂量5.4 g/（kg.d），中剂量2.7 g/（kg.d），低剂量1.35 g/（kg.d）灌胃。连续灌胃12周。收集各组大鼠尿液、股动脉血。检测血ca、血P、尿ca、尿Cr、0c、ALP、TRAP、DPD及尿Ca/Cr。结果骨疏颗粒高剂量组血Ca浓度与戊酸雌二醇组无差异（P>0.05）；骨疏颗粒高中低剂量组0C均高于戊酸雌二醇组（P<0.05）；骨疏颗粒高剂量组ALP及TRACP与戊酸雌二醇组比较无差异（P>0.05）；骨疏颗粒高中低剂量组DPD均低于戊酸雌二醇组（P<0.05），骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组Ca/Cr无差异（P>0.05）。结论骨疏颗粒与戊酸雌二醇均能降低骨吸收标志物，增加骨形成标志物，改善绝经后大鼠骨质疏松相关指标。

关键词：骨质疏松；骨疏颗粒；骨形成标志物；骨吸收标志物；动物实验

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2017）03-0068-04

绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis，PMPO）常见和多发于绝经后妇女，雌激素缺乏是主要病因。随着我国人口老龄化不断加剧，由骨质疏松症导致老年人发生骨折和（或）致残的住院率不断上升，这已成为棘手的公共卫生问题。骨疏颗粒是本院治疗骨质疏松症的科研观察用药，前期试验研究显示，该方能改善骨质疏松症相关症状，提高腰椎骨密度水平。为进一步揭示骨疏颗粒的抗骨质疏松机制，笔者开展了该项研究，探讨骨疏颗粒对骨形成、骨吸收等骨代谢相关指标的影响。

1资料与方法

1.1造模与分组 清洁级健康雌性未孕SD大鼠90只，3月龄，体重（250±20）g，由昆明医科大学实验动物学部提供，合格证号：SCXK（滇）2015-0002。实验室环境温度20-25℃，湿度40%-50%。实验动物饲养于昆明医科大学实验动物学部。

适应性喂养1周后，随机抽取大鼠15只作为假手术组，余75只作为手术造模组。手术造模组通过手术切除双侧卵巢的方法建立绝经后骨质疏松症动物模型，假手术组不切除卵巢仅切除卵巢周围少量脂肪组织。术后12周，手术造模组与假手术组各随机抽取2只大鼠，取其左后肢股骨进行病理组织切片确定造模成功。将手术造模组存活的60只大鼠随机分为模型组、戊酸雌二醇组、骨疏颗粒高剂量组、骨疏颗粒中剂量组、骨疏颗粒低剂量组5组，每组12只；假手术组作为空白对照组。分别进行相应药物干预，空白对照组、模型组给予生理盐水10ml/（kg.d）灌胃，持续12周；戊酸雌二醇组给予戊酸雌二醇片0.09mg/（k昏d）灌胃，持续12周；骨疏颗粒高、中、低剂量组分别按照高剂量5.4 g/（kg.d），中剂量2.7 g/（kg.d），低剂量1.35 g/（k昏d）灌胃，持续12周。实验全程普通饲料喂养，自由进食、进水。相应药物干预12周后，在处死前将大鼠置于代谢笼内收集尿液，离心后冰冻保存待检；接下来处死全部实验大鼠，股动脉取血，离心后冰冻保存待检。

1.2药品与试剂

1.2.1药品 骨疏颗粒：云南中医学院第一附属医院制剂中心提供，由狗脊、黄芪、白术、三七、独活等药组成，10g/袋；戊酸雌二醇片（补佳乐）：拜耳医药保健有限公司生产，1 mg×21片/盒。生产企业：DELPHARM lille S.A S；进口药品注册证号：H20120368；药品批准文号：国药准字J20130009。

1.2.2试剂 生化指标试剂盒（武汉优尔生生物科技股份有限公司生产）；骨代谢标志物：骨形成标志物血清骨钙素（OC）（批号201603029）、血清碱性磷酸酶（ALP）（批号P0321），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）（批号P0332）、尿脱氧吡啶啉（DPD）（批号P0341）。

1.3实验方法

1.3.1造模 应用Saville手術切除雌性大鼠双侧卵巢的方法建立绝经后骨质疏松症动物模型，假手术组不切除卵巢。喂养12周后，假手术组、手术造模组各随机抽取2只大鼠取左后肢股骨行病理切片确定造模成功与否。

1.3.2给药方法 造模成功后，将手术造模组60只大鼠随机分为模型对照组、戊酸雌二醇组、骨疏颗粒高剂量组、骨疏颗粒中剂量组、骨疏颗粒低剂量组5组，每组12只；假手术组作为空白对照组，分别进行不同药物干预。空白对照组、模型对照组给予生理盐水10 mL/（kg.d）灌胃，持续12周；戊酸雌二醇组给予戊酸雌二醇片0.09 mg/（kg.d）灌胃，持续12周；骨疏颗粒高、中、低剂量组分别按照高剂量5.4 g/（kg.d），中剂量2.7 g/（kg.d），低剂量1.35 g/（kg.d）灌胃，持续12周。实验全程普通饲料喂养，自由进食、进水。

1.3.3观察指标及检测方法 （1）血Ca、血P、尿Ca、尿Cr使生化法进行检测；（2）OC、ALP、TRAP、DPD检测，使用ELISA法检测；（3）大鼠左后肢股骨骨病理检测骨小梁数、骨小梁面积百分数、骨小梁分离度、骨小梁厚度。骨标本取材及制备：用3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后股动脉彻底抽血处死，分离股骨，去除肌肉，将骨样本置于10%磷酸盐缓冲液配制的甲醛溶液中固定24 h，再经70%乙醇脱水后，用特殊骨染料染色5天。以后用50%乙醇开始逐级脱水及丙酮脱脂，最后用甲丙烯酸甲酯包埋不脱钙骨，包埋块干后锯成300 mm骨片，经磨成20 mm的薄片再次梯度脱水，透明封固。

1.4统计学分析方法 应用SPSS 20.0统计软件进行分析。多组间比较根据资料的性质不同，分别选用One-Way ANO-VA和Kruskal-Wallis Test的比较方法。单因素方差分析用于完全随机设计的多个样本均数间的比较，其统计推断是推断各样本所代表的各总体均数是否相等。方差分析的两个基本假设：1）各样本是相互独立的随机样本，均服从正态分布；2）各样本的总体方差相等，即方差齐性（homogeneityofvari-ance）。若不能满足以上两个条件，采用Kruskal-Wallis Test非参数方法。

2实验结果

2.1大鼠存活情况 假手术组大鼠，手术中及术后死亡2只，造模组大鼠手术手术中及术后死亡15只。灌胃操作致使大鼠死亡7只。试验后期空白对照组大鼠精神状况良好，被毛光泽；模型组大鼠蜷缩嗜睡，活动较少，被毛无光泽且有脱落；戊酸雌二醇组与骨疏颗粒不同剂量组大鼠活动尚可，精神状况良好。

2.2造模成功的判定 观察统计2组大鼠左后肢股骨骨组织病理片骨小梁数、骨小梁面积百分、骨小梁分离度、骨小梁厚度数据比较见表1。

表-1可知，骨小梁数、骨小梁面积百分数、骨小梁分离度、骨小梁厚度4项指标假手术组与手术造模组间之间差异有统计学意义（P<0.01），假手术组的骨小粱数、骨小梁面积百分比、骨小梁厚度均高于手术造模组，假手术组骨小梁分离度低于手术造模组。两组间比较：手术造模组出现严重骨质疏松，说明造模成功。

2.3各组大鼠血清矿物质水平比较 见表2。

表2可知，与空白对照组比较，模型组血钙明显高于空白对照组（P<0.01），与模型组比较，骨疏颗粒高剂量组和戊酸雌二醇组血钙浓度明显低于模型组（P<0.01），与戊酸雌二醇组比较，骨疏颗粒高剂量组血钙浓度与之无差异（P>0.05）。

2.4各组大鼠骨形成标志物水平比较 见表3。

表3可知，模型组OC明显高于空白对照组（P<0.01），骨疏颗粒高剂量组和戊酸雌二醇组OC低于模型组（P<0.05），骨疏颗粒高剂量组OC高于戊酸雌二醇组（P<0.05）；骨疏颗粒高剂量组OC低于中、低剂量组（P<0.05）；模型组ALP明显高于空白对照组（P<0.01）；骨疏颗粒高剂量组和戊酸雌二醇组ALP明显低于模型组（P<0.01），骨疏颗粒高剂量组ALP浓度与戊酸雌二醇组无差异（P>0.05）；骨疏颗粒高剂量组ALP浓度低于中、低剂量组（P<0.05）。

2.5各组大鼠骨吸收标志物水平比较 见表4。

表4可知，模型组TRACP明显高于空白对照组（P<0.01），戊酸雌二醇组和骨疏颗粒高剂量组TRACP均明显低于模型组（P<0.01），骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间无差异（P>0.05），骨疏颗粒高剂量组TRACP浓度低于低、中剂量组（P<0.05）；模型组DPD明显高于空白对照组（P<0.01）；戊酸雌二醇组和骨疏颗粒不同剂量组DPD均低于模型组（P<0.01），骨疏颗粒不同剂量组与戊酸雌二醇组均能降低DPD水平，戊酸雌二醇优于骨疏颗粒不同剂量组，骨疏颗粒高剂量组DPD浓度低于低、中剂量组（P<0.05）；模型组Ca/Cr明显高于空白对照组（P<0.01）；戊酸雌二醇组和骨疏颗粒高剂量组Ca/Cr水平明显低于模型组（P<0.01），骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间无差异（P>0.05），高剂量组降低Ca/Cr水平优于低、中剂量组（P<0.05）。

3讨论

PMOP的发生是由于妇女在绝经后卵巢功能逐渐衰退，体内雌激素水平下降，以进行性骨丢失、骨小梁退行性改变、骨脆性增加及易发生骨折为特征的全身代谢性骨疾病。体内雌激素的缺乏是导致PMOP发生的主要原因。20世纪80年代Gray等首先在体外培养的成骨细胞上发现了ER的存在，雌激素主要通过雌激素受体（ER）来发挥效应。人体的骨代谢是一个动态平衡过程，主要由破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成调控。张健等认为雌激素对骨代谢的调节作用主要通过阻止骨吸收来抑制因绝经引起的骨重建高转换状态，达到防治骨丢失、维持骨量的目的。雌激素缺乏还引起的骨吸收亢进，主要是破骨细胞产生过多和静息态的破骨细胞被激活后活性增强。研究表明当雌激素缺乏时，其促进骨形成的作用效能降低，出現骨形成障碍。在骨代谢过程中会产生一些标志物，这些标志物水平的高低可以评估骨代谢状况，骨形成标志物有ALP、OC等，骨吸收标志物包括TRACP、DPD、Ca/Cr等。人体在正常情况下血钙、血磷的浓度呈负相关。当骨质疏松病情较为严重时，骨吸收较明显，血钙的浓度会升高，而血磷的浓度则下降。本实验表明，使用骨疏颗粒与戊酸雌二醇治疗后血磷水平上升、血钙水平下降，推测上述2药能抑制骨吸收，减少骨钙流向血液；ALP水平与成骨细胞和前成骨细胞活性呈线性关系，具有较高的骨组织特异性，被认为是骨形成标志物。OC是一种由成骨细胞分泌的反映骨转换率的血清检测物。本实验显示，骨疏颗粒和戊酸雌二醇均降低ALP、OC，说明两药能有效促进骨形成；在骨吸收过程中破骨细胞能向血中释放TRACP，其活性与骨吸收强度相平行。DPD仅存于骨的I型胶原纤维中，当破骨细胞活动时从尿中排出，它的实验室检测不受饮食影响。尿钙/尿肌酐（Ca/Cr）比值也是反映骨吸收的廉价的指标，能够反映骨吸收水平。本实验表明2药均能降TRACP、DPD、Ca/Cr，推测两药能减弱骨吸收强度。

总之，本实验表明骨疏颗粒和戊酸雌二醇均能对骨质疏松大鼠的骨代谢标志物产生影响，具体表现为降低骨形成标志物，增加骨吸收标志物，其作用强度与骨疏颗粒的药物浓度有正相关趋势。结合既往的实验研究推测，骨疏颗粒与雌激素有相似的作用机制，都是通过调控成骨细胞和破骨细胞的活性发挥发挥抗骨质疏松作用的。

（收稿日期：2016-12-20）