鹅细小病毒VP3蛋白抗血清的制备及在鸭胚和鸭胚成纤维细胞中的增殖研究

牛银杰, 刘柏含, 赵丽丽, 孙 畅, 陈洪岩

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室, 实验动物与比较医学创新团队, 哈尔滨 150069)

鹅细小病毒VP3蛋白抗血清的制备及在鸭胚和鸭胚成纤维细胞中的增殖研究

牛银杰, 刘柏含, 赵丽丽, 孙 畅, 陈洪岩

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室, 实验动物与比较医学创新团队, 哈尔滨 150069)

目的 制备鹅细小病毒(GPV) VP3衣壳蛋白的兔抗血清, 在绍兴麻鸭鸭胚及其成纤维细胞中成功增殖GPV。方法 根据GPV H 分离株的VP3基因序列构建原核表达载体pET3a -VP3，诱导纯化VP3蛋白, 皮下注射免疫新西兰白兔, 收集和纯化VP3抗血清, 经Western blotting检测VP3抗血清与VP3蛋白的反应性。GPV H株鹅胚尿囊液接种SPF绍兴麻鸭胚和其成纤维细胞, 通过PCR反应和间接免疫荧光方法, 检测GPV在鸭胚及其成纤维细胞中的增殖。结果 成功制备了VP3的兔抗血清，同时GPV在鸭胚及其成纤维细胞中进行良好增殖。 结论 VP3抗血清的制备及GPV在绍兴麻鸭鸭胚及成纤维细胞中的增殖实验为GPV分子生物学特性及致病机制的研究奠定基础。

鹅细小病毒(GPV); VP3基因; VP3抗血清; 增殖

小鹅瘟(Gosling plaque)，是由鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)引起的一种急性、高度接触性、败血性传染病, 该病具有病程短、传染性强、传播快、死亡率高等特点[1]。GPV属于细小病毒科，细小病毒属，病毒粒子为六角形或球形,无囊膜，其基因组为单链、线性DNA，大小约5.2 kb，由两个开放读码框组成，右侧读码框编码衣壳蛋白VP1，VP2和VP3，左侧编码非结构蛋白NS1和NS2[2]。其中VP3衣壳蛋白是GPV的主要衣壳蛋白, 约占衣壳蛋白总量的80%, 是主要免疫保护型抗原蛋白[3-5]。目前，GPV的夹心ELISA 方法还未建立，因此VP3抗血清的制备是十分必要。

GPV对体外培养物的专一性很强，初代分离培养GPV时，只能用鹅胚、番鸭胚及鸭胚成纤维细胞(DEFs)，其他细胞和禽胚均不能使其增殖。GPV 经鹅胚连续培养十几个代次后，在DEFs中培养，不能形成病变, 培养物中病毒的滴度也很低。病毒分离及繁殖的局限阻碍了GPV致病机制及其生物学特性的研究。

本实验在麻鸭胚及其DEFs培养增殖GPV, 利用原核表达系统表达VP3蛋白, 制备VP3兔抗血清, 为GPV诊断方法的建立及其致病机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和实验动物

质粒pET30a由本实验室保存，DEFs由本实验室制备; 绍兴麻鸭鸭胚取自哈尔滨兽医研究所实验动物中心[SCXK(黑)2011-008], [SYXK(黑)2011-022];感受态细胞BL21(DE3)和DNA marker购自TaKaRa公司。SPF 新西兰白兔购自长春生物制品有限公司[SCXK(吉)-2013-0002]。

1.2 主要试剂和培养基

T4 DNA 连接酶和限制性内切酶购自美国NEB公司。质粒提取试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自全式金公司，DNA提取试剂盒购自美国Omega公司。弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自德国Sigma公司。异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自索莱宝。兔源红外标记抗体购自LI-COR公司。

1.3 病毒的增殖

200 mL GPV 尿囊液接种8个11日龄绍兴麻鸭,记录鸭胚的死亡情况, 并观察胚体的变化。同时在DEFs上接种GPV, 观察细胞的病变情况。收取尿囊液和细胞上清, 提取病毒DNA, 进行PCR鉴定。

1.4 载体的构建和鉴定

根据H 株VP3基因序列设计上下游引物，上游: CGGGATCCA TGGCAGAGGGAGG AGGCGGAGCTT(下划线为酶切位点); 下游: CCAAGCTTTTACAGATTTTGAGTTAGATATCTG(下划线为酶切位点)扩增VP3基因。将扩建成功的VP3与载体pET30a进行双酶切, 凝胶回收后, 使用T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接。将连接产物转化感受态BL(DE3)，挑取菌落PCR鉴定阳性菌，经测序鉴定成功的重组质粒命名为pET 30a-VP3。

1.5 重组蛋白诱导纯化

将活化后的重组菌液1∶100转接至100 mL含100 mg/L Kana的LB培养基中37℃培养至A600=0.4～ 0.6, 1∶100加入诱导剂IPTG，37℃继续培养4 h。将培养的菌液进行蛋白纯化。

1.6 抗血清的制备

将纯化好的蛋白与等体积的弗氏佐剂充分乳化后, 每只兔1 mg的用量进行背部皮下多点注射。初次免疫使用完全佐剂，二次和三次免疫使用不完全佐剂, 其时间间隔为2周。经兔耳缘静脉采血, 采用间接ELISA测定兔血清效价。三次免疫后间隔1周加强免疫, 心脏采血, 分离血清, 分装后保存备用。

1.7 Western blotting鉴定抗血清的反应原性

分别收集小量诱导表达纯化的蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，用半干法将蛋白转到硝酸纤维素膜(NC膜)上，进行封闭2 h，洗膜3次每次5 min后，加入1∶200稀释的兔抗血清室温孵育2 h, PBST 漂洗一抗后加入1∶8 000稀释兔源红外标记抗体，室温温育1 h，洗膜3次后，红外扫描保存结果。

1.8 间接免疫荧光检测

制作原代DEFs细胞，消化细胞均匀铺在6孔板中，细胞长至80%～90%，接种100个50%组织细胞感染量(TCID50) GPV, 37 ℃体积分数5% CO2温箱中培养48 h后，VP3抗血清为一抗，异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG为二抗，利用倒置荧光显微镜观察。

2 结果

2.1 病毒的增殖情况

GPV接种鸭胚4 d后, 无鸭胚死亡, 观察胚体无明显病变, 与对照一致。而DEFs在120 h出现病变。提取尿囊液核酸, PCR鉴定在1 605 bp位置出现条带(图1), 证明GPV在鸭胚中进行了良好的增殖。

图1 GPV增殖的PCR鉴定Figure 1 Identification of GPV replication by PCR

2.2 原核载体pET30a-VP3的鉴定及VP3蛋白表达

pET30a-VP3测序结果正确。诱导表达蛋白经过纯化大小与预期VP3蛋白大小一致，约为70 000,证明成功表达VP3蛋白(图2)。

图2 重组VP3蛋白的SDS-PAGED的鉴定Figure 2 Identification of recombinant VP3 protein by SDS-PAGE

2.3 Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性检测

Western blotting结果表明兔多抗具有特异性和良好的反应原性(图3)。

2.4 间接免疫荧光

VP3抗血清与接种GPV的DEFs反应良好，与没有接毒的细胞无反应(图4)。进一步说明GPV在DEFs中具有良好的增殖。

图3 VP3的Western blotting鉴定Figure 3 VP3 identification of Western blotting

3 讨论

GPV的自然宿主是鹅和番鸭，所有品系的家鹅均易感，除番鸭和莫斯科鸭外，其他动物均无易感性[6]。GPV在进行初次分离时，只能用鹅胚和番鸭胚或是它们的原代成纤维细胞才能使它们增殖进行分离。在本研究中，利用绍兴麻鸭及其

图4 VP3的间接免疫荧光鉴定Figure 4 VP3 identification of Indirect immunofluorescence

DEFs增殖GPV，结果表明，GPV能在麻鸭胚及其DEFs进行良好的增殖。GPV在麻鸭胚及其DEFs的增殖为GPV致病机制的研究奠定了基础。

GPV的基因编码衣壳蛋白VP1, VP2和VP3，他们有共同的羧基端。其中VP3是主要结构蛋白，约占总蛋白的80%[7]。VP3蛋白氨基酸序列大多位于病毒粒子的表面, 含有GPV的主要抗原决定簇, 可以诱导产生中和抗体[8]。为了构建夹心ELISA方法,作者构建了原核表达载体pET30a-VP3, 诱导表达了VP3蛋白, 免疫新西兰白兔, 制备了VP3兔抗血清。VP3蛋白和VP3抗血清的成功制备, 为VP3蛋白单抗的制备及其诊断方法的建立提供了便利条件。

[1] 吴清民. 兽医传染病学[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 2002:312-315.

[2] 殷震, 刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版. 北京: 科学出版社, 1997:1165-1167.

[3] Le Gall-Recule G, Jestin V, Chagiaud P. Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP32 and VP33) in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins[J]. J Gen Virol, 1996, 77(9):2159-2163.

[4] 刘海霞, 刘海涛, 张蜻, 等. 鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达[J]. 中国兽医科学, 2007, 37(9):772-776.

[5] 许洪洁, 张鑫, 夏铭琦, 等.小鹅瘟病毒VP3基因真核表达质粒在小鼠中的免疫效果[J]. 中国兽药杂志, 2008, 42(1):5-8.

[6] Takehara K, Nakata T, Takizawa K, et al. Expression of goose parvovirus VP1 capsid protein by a baculovirus expression system and establishment of fluorescent antibody test to diagnose goose parvovirus infection[J]. Arch Virol, 1999, 144 (8):1639-1645.

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[8] Zadori Z, Stefancsik R, Rauch T, et al. Analysis of the complete nucleotide sequences of goose and muscovy duck parvoviruses indicates common ancestral origin with adeno-associated virus 2[J]. Virology, 1995, 212(2):562-573.

Preparation of Goose Parvovirus VP3 Antiserum and Identification of Propagation in Duck Embryo and Duck Embryo Fibroblasts

NIU Yin-jie, LIU Bai-han, ZHAO Li-li, SUN Chang, CHEN Hong-yan
(Division of Laboratory Animal and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China)

ObjectiveTo prepare antiserum against VP3 protein and propagate goose parvovirus (GPV) H in duck embryo and duck embryo fibroblasts (DEFs) .MethodsThe prokaryotic expression vector pET30a-VP3 were constructed based on VP3 seqeucne of GPV H. VP3 protein was induced, expressd and purified, then immunized the New Zealand white rabbit. The VP3 antiserum was collected, purified and verified by Western blotting. GPV H fluid was inoculated into shaoxing duck embryo and DEFs, and the propagation of GPV was identified by PCR and indirect immunofuorescence. Result The VP3 antiserum was successfully prepared, and GPV H was well propagated in shaoxing duck embryo and DEFs .ConclusionVP3 antiserum preparation and GPV replication in duck embryo and DEFs may be provided basis for GPV molecular biological characteristic and pathogenic mechanism research.

Goose parvovirus (GPV); VP3 gene; VP3 antiserum; Propagation

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0240-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.014

2017-04-06

国家科技支撑计划(2015BAI07B02-02); 中国农业科学院基本科研业务费专项(Y2016PT41); 黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD2016006)

牛银杰(1987-), 女, 博士研究生, 研究方向: 预防兽医学。E-mail: niuyinjie0530@163.com;

共同第一作者: 刘柏含(1992-), 女, 硕士研究生,研究方向: 微生物学。E-mail: liubaihan456@163.com

陈洪岩(1963-), 男, 博士, 研究员, 研究方向: 实验动物与比较医学。E-mail: chenhongyan@caas.cn