头发中氯硝西泮的分段分析在药物辅助犯罪案件中的作用

陈航，向平，沈敏

（司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

头发中氯硝西泮的分段分析在药物辅助犯罪案件中的作用

陈航，向平，沈敏

（司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

目的通过分段分析头发中的氯硝西泮，对药物辅助犯罪案件中受害人的摄药频度及摄药史进行推断。方法采用液氮冷冻研磨技术联合超声浴技术，以液相色谱-串联质谱法，对6名不同案件中受害人的头发分段分析，并测定各头发段中的氯硝西泮及7-氨基氯硝西泮的含量。结果6名受害人的部分头发段中均检出氯硝西泮及其代谢物7-氨基氯硝西泮，且头发中药物峰值浓度的出现时间与受害人自述摄药时间相一致。结论头发分段分析可提供摄药频度与摄药时间信息，在药物辅助犯罪案件中具有独特的证据价值。

法医毒理学；氯硝西泮；头发；化学，分析；药物辅助犯罪

药物辅助犯罪是指利用药物损伤受害人的行为能力而实施的麻醉抢劫、性侵犯等不法行为，其中以药物辅助性侵犯（drug facilitated sexual assault，DFSA，又称迷奸）为主[1]。当前，国内外的药物辅助犯罪案件均呈上升趋势，此类案件除对受害人造成人身伤害和财产损失、引发中毒或死亡外，还会引发社会公众恐慌，对公共安全造成极大的威胁[2，3]。

药物辅助犯罪案件中，由于用药剂量小，体液检材获取不及时等问题，一直是法医毒物鉴定的难点。头发检材具有易获取、易保存、检出时限长（数周至数月）、能反映长程用药信息等优点[4]，已成为国际法医学界广泛接受和使用的新型生物检材[5，6]。现代分析技术的飞速发展使单次摄药的头发分段分析成为可能。本实验室在多年毛发分析研究[7-9]的基础上，将高灵敏度的液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术结合液氮冷冻研磨技术，在保证化学性质不稳定目标物不降解的同时，快速将富角蛋白的硬质毛发粉碎为微米级颗粒，成倍扩展比表面积，使用超声浴等纯物理手段大幅提高目标物的释放效率，使微量取样下的毛发分析变为现实。

本研究利用所建的冷冻研磨联合LC-MS/MS分析方法[8]，对4起迷奸案件中的6名受害人头发进行分段分析，讨论头发检材在药物辅助犯罪案件中的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

API 4000 QTRAP三重四极杆线性离子阱质谱仪（美国Applied Biosystems公司），AcquityTMUltra Performance LC超高压液相色谱仪（美国Waters公司），Minspin高速离心机（德国Eppendorf公司），6700冷冻研磨机（美国SPEX CertiPrep公司），Milli-Q超纯水制备系统（美国Millipore公司）。氯硝西泮、7-氨基氯硝西泮、氯硝西泮-d4均购自美国Cerilliant公司；乙腈（HPLC级）购自美国Sigma-Aldrich公司；乙酸铵（HPLC级）购自瑞士Fluka化学公司；其他化学试剂及药品均为分析纯。

1.2 分析方法

采用已建方法[8]进行分析。贴头皮剪取头发，根部对齐，以2cm为一段进行分段。取各段头发，分别以水、二氯甲烷清洗。自然晾干后液氮冷冻研磨，称取研磨所得头发粉末20 mg，加入2 mL pH=8.4硼砂缓冲液，超声浴处理1h。加入2.5mL乙醚涡旋，充分混合后离心，取有机层60℃水浴中挥干。残余物中加入100μL流动相复溶，取5μL进样测定。

色谱条件：液相柱为Restek Allure PFP丙基柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），前接Phenomenex保护柱（12.5mm×2.1mm，5μm）。流动相为V（乙腈）∶V（缓冲液）=70∶30，缓冲液为20 mmol/L乙酸胺-0.1%甲酸溶液。恒流200μL/min。

质谱条件：电喷雾电离-正离子模式（ESI+）。碰撞气（CAD）：7 psi。气帘气（CUR）：30 psi。离子喷射电压（IS）：5500V。雾化气（GS1）：35psi。辅助气（GS2）：35psi。离子源温度（TEM）：500℃。

1.3 案例

6名受害人，均为女性，在不同时间遭受性侵害，自述案发前均饮用过已开封或他人递送的可疑饮料，案发时均出现不同程度的意识模糊、四肢无力、无法反抗等症状，个别受害人案发后对部分过程不能回忆。一段时间后采集其头发，头发及相关信息详见表1。取6名受害人头发，以2cm为一段进行分段，按已建立的方法[8]对各发段进行分析。

表1 6名受害人的基本信息

2 结果

在每名受害人头发中，均有部分头发段检出氯硝西泮及其代谢物7-氨基氯硝西泮（图1），部分头发段则未检出氯硝西泮及其代谢物。

对6名受害人各段头发中的氯硝西泮及其代谢物进行定量分析（表2）。分析结果显示，氯硝西泮及其主要代谢物7-氨基氯硝西泮在受害人头发中均存在峰值；氯硝西泮在6名受害人阳性头发段中的质量分数范围在4.1～34.2pg/mg；除2号受害人外，7-氨基氯硝西泮在其余5名受害人阳性头发段中的质量分数范围在6.3～192.1pg/mg。

另取1号受害人、4号受害人头发，自发根起以0.5 cm为一段进行分段，重点分析近发根部0～5 cm段。分析结果显示（图2），1号受害人、4号受害人头发中氯硝西泮及7-氨基氯硝西泮的峰值均出现在1.5～2.0cm段。其中，1号受害人头发中氯硝西泮峰值质量分数为32.3pg/mg，7-氨基氯硝西泮峰值质量分数为117.3pg/mg；4号受害人头发中氯硝西泮峰值质量分数为29.6pg/mg，7-氨基氯硝西泮峰值质量分数为192.0pg/mg。

图1 6名受害人阳性头发段的MRM色谱图

表2 6名受害人头发中氯硝西泮及其代谢物的分布情况（pg/mg）

图2 1号和4号受害人近发根部头发中氯硝西泮及其代谢物的分布情况

3 讨论

药物辅助犯罪案件中所涉药物包括中枢神经抑制剂、兴奋剂、致幻剂等精神活性物质[10，11]。近年来，鉴定中发现氯硝西泮在药物辅助犯罪案件中的出现率有增多趋势，其药物多制成乳剂并赋予诱惑性名称（如“弥漫之夜”“恶魔丘比特”“听话水”）或英文代号。此类案件常为单次摄药，且药物使用剂量小、代谢快、体内含量低。另一方面，待受害人清醒并发现有财物损失或遭受性侵犯时，通常距摄药已过去数小时，甚至更长时间，部分受害人限于心理压力和社会因素等，报案不及时，此时其体液检材往往已无法提供有效的摄药证据。头发检材独有的易获取保存、检出时限长（数周至数月）、能反映长程的用药信息等优势[4]，使其在此类案件中往往能提供其他渠道无法获得的关键信息。

3.1 摄药频度的区分

头发中目标物的含量范围可用于初步区分摄药频度。正常情况下，头发中的目标物质量分数与摄入总量存在正相关性，偶尔或单次摄药后，药物进入头发呈一过性趋势，长期或持续摄药后，药物随摄药频度反复多次进入头发，并在头发中积蓄存在。如John等[12]分析了11名服用氯硝西泮6～60d的患者头发，其目标物质量分数范围为1 156～10400pg/mg。而单次摄药者头发中氯硝西泮水平普遍较低。在Negrusz等[13]的研究中，10名单次摄入氯硝西泮志愿者在服药后第28天被采集头发，其中0～2cm头发段氯硝西泮<23pg/mg。本实验室曾在两名单次摄入氯硝西泮女性的头发中，测得氯硝西泮的峰值质量分数分别为11.9pg/mg和15.5pg/mg[14]。本研究中，6名受害人阳性头发段内的氯硝西泮质量分数范围在4.1～34.2pg/mg，与文献报道的单次摄药后头发中氯硝西泮质量分数范围相近，同时远小于长期服用氯硝西泮患者头发中目标物的质量分数。

通过头发分段分析并对各头发段中目标物的分布情况进行分析，是进一步辨明摄药频度的关键。当药物由血液循环进入头发毛囊并固化于毛干后，会随头发的生长从发根向发梢移动。通过分段分析，可以相对准确地反映被鉴定个体的涉药史和用药变化[15]，其分析结果成为用药史调查的最优表现形式[9]。理论上，自发根起的每1cm头发的分析结果，都恰好反映所对应月的摄药情况。本研究团队通过对涉艾司唑仑、氯硝西泮和氯胺酮等目标物的头发进行分段分析，发现由于头发存在生长速度和周期差异、汗液污染、主动扩散、头发采样及分段误差等影响因素，使阳性点分散，在对成束头发分析时，多段中均可呈阳性结果[8，16]。综合这些因素，国际毛发分析协会前主席Kintz等[5]近期提出建议，如果属单次摄药的药物辅助犯罪案件，那么对应案发时间的头发段中药物质量分数应最高，且与之前、之后的相邻头发段中质量分数相比，至少高3倍以上。本研究中6名受害人头发中氯硝西泮呈单一峰值，4号、5号、6号受害人头发中氯硝西泮分析结果以及2号和3号受害人头发中代谢物分析结果符合此单次摄药判断建议，1号受害人头发重新按0.5 cm分段分析后也符合此建议（峰值1～3cm段）。由于药物在毛干上易扩散，必要时可进行更为细致的分段分析（如0.5 cm）和增加分析目标物（如代谢物），以利于更好地观察药物在毛干上的分布。

3.2 摄药时间的推断

头发生长速率约为1cm/月（范围0.7～1.4cm/月）[17-19]，在头顶枕部区域（图3）该生长速率尤为稳定。剪取该区域的头发检材，通过分段分析考察峰值质量分数段的出现位置，以对摄药时间进行回推。本研究中6名受害人的头发检材均取自该区域，采集距案发时长分别约为2个月、6个月、6个月、2个月、1个月和7个月，其对应的头发中氯硝西泮出现峰值质量分数的头发段分别为0～2cm段、6～8 cm段、6～8 cm段、0～2 cm段、0～2cm段和6～8cm段，与头发采集距案发时长间互相吻合。通过对1号受害人和4号受害人头发进一步更为精确的分段分析，头发中氯硝西泮质量分数峰值出现的头发段约为1.5～2.0cm段，和受害人自述的被侵犯时间相符（约60d）。

图3 头顶枕部区域位置

3.3 头发分段分析的影响因素

除毛发本身、生长周期等内部因素影响，烫染发、环境干扰等外部条件也影响着毛发分析结果的法医学解释。目标物在头发中稳定存在，然而部分洗发产品、紫外线照射、烫染等均有可能影响头发结构，一方面可能造成头发中目标物的流失，另一方面也可能会加速由汗液及皮脂腺带来的药物侵入。在本研究中，1号受害人和5号受害人有染发习惯，其中5号受害人于受侵害后一周内曾再次染发，2号受害人时常改变发型及发色，其发质干枯，有较多分叉，3号、4号、6号受害人无烫染发习惯。通过比较6人头发中目标物含量及比例可知，头发未经烫染的三名受害人头发中，氯硝西泮与7-氨基氯硝西泮的峰值质量分数比为0.18～0.22，染过色的两名受害人头发中，氯硝西泮与7-氨基氯硝西泮的峰值质量分数比超过了0.38，烫染频度较高的2号受害人头发段中，7-氨基氯硝西泮的质量分数显著降低。由于7-氨基氯硝西泮的稳定性不如氯硝西泮，很可能在因烫染而受到损伤的头发中发生分解和流失。故实践中应记录头发颜色、烫染等美发处理情况。

运用头发分段分析推断摄药时间可能存在一定的误差。对摄药时间推断的主要影响因素包括以下几个方面：（1）头发生长速度存在个体差异，在0.7～1.4cm/月范围。（2）药物随血液循环进入毛囊，随毛囊的生长露于皮肤表面，成为毛干，再生长到剪刀可采集的程度，至少需要两周的时间。（3）停药后毛发周围的皮脂腺等周围附属结构中存在的药物仍在逐渐释放。（4）个体的每根头发处于不同的生长周期。在生长期的头发中药物随毛干生长而向发梢方向移动，而在休止期的头发中药物随头发仍停留在原位。（5）对头发进行采样、分段分析时均采用手工、剪刀进行，亦存在差异[9，20]。大部分药物辅助犯罪案件并不能按照案发后1个月采集头发，有的间隔时间较长。随着采样间隔时间的增长，上述影响因素更为突出，头发中药物质量分数高峰与摄药时间的对应上可能更为模糊。

药物辅助犯罪案件的认定较为复杂，多种检材的联合分析有利于分析结果的解释。头发分段分析的阳性结果并不能区分主动与被动摄药，并且难以区分两周时间内的摄药。在上述案例中，4号受害人在前一日晚遭受性侵害，次日凌晨清醒后及时报案，警方即刻带领4号受害人至就近医院抽血，经检测，该血液中检出氯硝西泮成分。通过将血液与头发的分析结果相结合，将受害人的摄药时间精确至“天”。警方通过调取监控等技术手段，进一步将摄药时间锁定至“小时”，形成了完整充分的证据链，使得嫌疑人从一开始的拒不认罪转变为完整交代犯案过程。

头发中代谢物的检出可排除外污染干扰，提供摄入信息。本研究所涉的6名受害人头发中均检出7-氨基氯硝西泮，质量分数均大于氯硝西泮。药物进入毛发与其物理化学性质、特征官能团相关，苯环上的氨基可增强药物进入毛发而羟基则是相反作用。如Cirimele等[21]研究发现，26名因药物滥用致死的死者头发中7-氨基氟硝西泮质量分数明显高于氟硝西泮。毛发中更高质量分数的代谢物不仅降低了对检测技术灵敏度的要求，也有利于排除外污染造成的假阳性结果。

3.4 结论

本研究利用液氮冷冻研磨技术联合LC-MS/MS法分段分析头发中的氯硝西泮及其代谢物7-氨基氯硝西泮，6名迷奸案受害女性的相应头发段中均检出了氯硝西泮和7-氨基氯硝西泮，峰值发段与自述摄药时间相吻合。头发分段分析可在药物辅助犯罪案件中发挥独特的作用和价值，反映摄药的长程信息（数周至数月），提供摄药频度与摄药时间信息。值得关注的是，在药物辅助犯罪案件中，需将头发分段分析结果结合案情调查、现场勘验、其他检验分析等，进行综合评定。此外在头发分析结果评价中，应充分考虑头发生长速度、生长周期、头发采样、分段等差异以及药物可经汗腺、皮脂腺等分泌扩散进入毛干等因素的影响。

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The Role of Segmental Analysis of Clonazepam in Hair in Drug Facilitated Cases

CHEN Hang,XIANG Ping,SHEN Min
（Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,PRC,Shanghai 200063,China）

ObjectiveTo infer the frequency of dosage and medication history investigate of the victims in drug facilitated cases by the segmental analysis of clonazepam in hair.MethodsFreezing milling under liquid nitrogen environment combined with ultrasonic bath was used as sample pretreatment in this study,and liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used for the segmental analysis of the hair samples collected from 6 victims in different cases.The concentrations of clonazepam and 7-aminoclonazepam were detected in each hair section.ResultsClonazepam and its metabolite 7-aminoclonazepam were detected in parts of hair sections from the 6 victims.The occurrence time of drug peak concentration was consistent with the intake timing provided by victims.ConclusionSegmental analysis of hair can provide the information of frequency of dosage and intake timing,which shows an unique evidential value in drug facilitated crimes.

forensic toxicology;clonazepam;hair;chemistry,analytic;drug facilitated crimes

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.008

1004-5619（2017）03-0252-06

2016-10-24）

（本文编辑：严慧）

“十三五”国家重点研发计划资助项目（2016YFC080 0704）；上海市科委资助项目（15DZ1207500）；中央级科研院所基本科研业务资助项目（GY2017G-8）；上海市法医学重点实验室资助项目（17DZ2273200）；上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目（16DZ2290900）

陈航（1988—），男，博士，助理研究员，主要从事法医毒物化学研究；E-mail：chenh@ssfjd.cn

沈敏，女，研究员，博士研究生导师，主要从事法医毒物化学研究；E-mail：shenm@ssfjd.cn