基于HPLC-TOF-MS代谢组学方法的溴鼠灵毒性作用评价

严慧，卓先义，沈保华，向平，沈敏

（司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

基于HPLC-TOF-MS代谢组学方法的溴鼠灵毒性作用评价

严慧，卓先义，沈保华，向平，沈敏

（司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）

目的分析溴鼠灵中毒大鼠尿液的代谢特征，揭示溴鼠灵干预对大鼠毒性作用的分子机制。方法通过构建大鼠溴鼠灵中毒模型，采用高效液相色谱-飞行时间质谱（high performance liquid chromatographytime of flight mass spectrometry，HPLC-TOF-MS）获取大鼠尿液代谢轮廓，并用正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）进行多变量统计分析，找出与溴鼠灵毒性作用密切相关的差异代谢物。结果OPLS-DA得分图显示给药前后不同时间的大鼠尿液样本代谢物轨迹在各时间段内相似度较好，呈现各自聚类现象。比较溴鼠灵给药前后大鼠尿液样本，筛选出22个与溴鼠灵毒性相关的差异代谢物。结论溴鼠灵主要通过干扰大鼠体内的三羧酸循环、糖酵解、鞘脂代谢和色氨酸代谢等代谢通路发挥毒性作用，且溴鼠灵毒性作用具有累积效应。基于尿液HPLC-TOF-MS代谢组学方法可为溴鼠灵毒性作用的分子机制研究提供新思路。

法医毒理学；代谢组学；高效液相色谱-飞行时间质谱；溴鼠灵；大鼠

溴鼠灵（brodifacoum），又名溴鼠隆、大隆、杀鼠隆、溴联苯杀鼠萘、溴敌拿鼠，属第二代抗凝血杀鼠剂。其分子式为C31H23BrO3，化学名为3-[3-（4’-溴联苯-4-基）-1，2，3，4-四氢-1-萘基]-4-羟基香豆素，保留了第一代抗凝血杀鼠剂的4-羟基香豆素母核结构，末端甲基被苯基取代，增加了亲脂性，使生物半衰期和毒性增加[1-3]。因溴鼠灵具有杀鼠效果好、抗耐药性佳等优点被广泛使用，同时也是国内外引起中毒事件最多的抗凝血杀鼠剂之一[4，5]。溴鼠灵通过抑制维生素K环氧化物还原酶而切断维生素K循环，使含有谷氨酸残基的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ无法正常羧化，引起凝血功能障碍[6]。长期摄入溴鼠灵后即使使用特效解毒剂维生素K1进行治疗，治疗时间也需要八个月以上[7]。

由于溴鼠灵对已经形成的凝血因子无抑制作用，须等这些凝血因子在体内相对耗竭才能发挥作用，因此摄药3～5d后才出现中毒症状。溴鼠灵中毒早期可发生恶心、呕吐、腹痛，几天后出现典型的抗凝血剂中毒症状，表现为血尿、鼻出血、齿龈出血、皮下出血等，重者可有咯血、呕血、便血及其他重要器官出血，并发休克、昏迷，可死于脑出血、心肌出血[8]。由于溴鼠灵中毒潜伏期长，极具隐匿性，许多患者难以察觉溴鼠灵中毒这一事实，或是误认为摄入药物并未起作用、出现症状与摄药无关，往往耽误最佳治疗时机；中毒症状又极易被误诊为疾病引起出血，例如典型的血尿中毒症状分析只局限于局部疾病，缺乏全身性疾病或中毒的考虑；此外有时影像学会对诊断有所误导，例如超声检查时将血凝块误认为结石[9]。种种原因都会导致病情延误甚至中毒者死亡，而在司法鉴定实践中又易让罪犯逍遥法外造成司法不公[10]。

尽管溴鼠灵是目前国内使用最为广泛的杀鼠剂，其中毒毒理学研究也有近四十年的历史，但其毒性效应及作用机制至今尚未完全阐明。代谢组学研究致力于生物样本中所有小分子代谢物的定性和定量测定，目前已成功应用于生理状态评估、药物安全评价、人类疾病诊断、药物治疗监测领域[11]。由于采取的分析技术足够灵敏，往往可以监测到体液复杂混合物中的细微变化，已有大量文献将代谢组学用于毒物肝毒性和肾毒性的评估[12，13]。

本研究以大鼠为实验模型，采用基于高效液相色谱-飞行时间质谱（high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry，HPLC-TOFMS）代谢组学技术筛选和鉴定溴鼠灵中毒前后大鼠尿液差异代谢物，了解溴鼠灵多次给药后大鼠尿液HPLC-TOF-MS代谢产物谱的改变，并研究其毒性损伤和作用机制，为溴鼠灵中毒的诊断和防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1290Infinity超高效液相色谱系统和6530四极杆-飞行时间质谱仪均购自美国Agilent公司。

HPLC级甲醇购自德国Merck公司，HPLC级乙腈购自美国Sigma公司，甲酸购自瑞士Fluka公司，超纯水由Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）制备，溴鼠灵药液（0.5%）购自上海市卫生害虫防治公司。

1.2 动物实验

清洁级雄性Wistar大鼠10只，体质量为（200± 20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。大鼠饲养于昼夜交替（12h∶12h）的房间内并给予标准饲料，控制室内温度为21℃～23℃，相对湿度40%左右，适应性喂养1周。每日9时许灌胃给药1次，连续15d形成溴鼠灵中毒模型。前8d溴鼠灵给药剂量为2.7μg/kg，后7d为13.5μg/kg。

将大鼠置于代谢笼，收集给药前、给药第8天、第15天24h尿液。在收集尿液的试管外置冰袋保持低温。将尿液在4℃下，以离心半径6cm，13000r/min，离心10min，取上清液保存在-80℃冰箱中，待测。

1.3 样品预处理

将尿液置于室温下融化，取100μL尿液样品，加入300μL超纯水，混旋后，在4℃下，以离心半径6cm，13000r/min，离心10min，取上清液过滤膜（0.22μm），置于进样小瓶用于HPLC-TOF-MS分析。

1.4 仪器分析条件

色谱柱为Acquity UPLC HSS T3色谱柱（美国Waters公司），柱温40℃。流动相A为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为0.1%的甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脱，梯度程序设置如下：0～2min，2%B；2～17min，2%～95%B；17～19 min，95%B。平衡色谱柱5 min，流速350μL/min，进样量为3μL。

质谱为电喷雾离子源（ESI），采用正、负离子模式进行检测。检测参数：毛细管电压4000V，干燥气流速11L/min，干燥气温度350℃，喷雾气压0.3103MPa，碎裂电压120 V，锥孔电压60 V，数据采集范围质荷比（m/z）100～1000。选取m/z为121.0509和922.0098的内标离子作实时质量数校正。

1.5 数据分析

采用Mass Profiler v B.02.00软件（美国Agilent公司）对HPLC-TOF-MS采集的数据进行峰识别和峰匹配，获得二维数据矩阵，包括变量（保留时间-质荷比）、观察量（样本）和峰强。采用SIMCA-P+软件v13.0（瑞典Umetrics公司）进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）。根据模型的变量重要性因子（variable importance in projection，VIP）大于1.5，并结合t检验结果（检验水准α=0.05）筛选潜在的差异代谢物，然后通过精确分子质量信息和METLIN数据库鉴定差异代谢物。

2 结果

2.1 尿液代谢组分析

大鼠溴鼠灵给药前后共30份尿液样本经预处理后，用HPLC-TOF-MS方法分别在正、负离子模式下进行分析检测，典型的溴鼠灵中毒大鼠尿液总离子流色谱图（total ion chromatogram，TIC）见图1。正离子模式下共得到1802个变量，负离子模式下获得1634个变量，然后进行多变量统计分析。

图1 典型的尿液总离子流色谱图

图2 UPLC-TOF-MS正、负离子模式的PCA得分图

对给药前和给药后尿液代谢组进行PCA，获得PCA得分图（图2）。各样本点集中分布于得分图的椭圆形区域（95%置信区间），给药15d与给药前尿液代谢组明显分开，而给药8d与给药前相比，区分则不太明显。

2.2 差异代谢物的挖掘和鉴定

为鉴别溴鼠灵毒性相关的差异代谢物，进一步采用监督性的OPLS-DA对给药前和给药15 d样本进行分析。结果正离子模式下得到1个主成分和1个正交成分，R2X=0.360，R2Y=0.997，Q2=0. 967；负模式下得到1个主成分和1个正交成分，R2X=0.422，R2Y= 0.989，Q2=0.950。此外，通过对模型进行排序验证，该模型不存在“过拟合”现象，得到结果见图3。

根据VIP值和t检验结果，共筛选出22个与溴鼠灵毒性相关的差异代谢物，其中脯氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸、S-Adenosylmethioninamine、酮戊二酸、柠檬酸、苹果酸、丙酮酸、吲哚乙酸、吲哚酚硫酸、马尿酸、磷酸胆碱、苏氨酸、戊二酸、乙酰乙酸、龙胆酸、辅酶Q、维生素B6共17种代谢物浓度在给药15d后显著降低，而8-Amino-7-oxononanoic acid、尿苷、烟尿酸、二氢神经鞘氨醇、植物鞘氨醇5种代谢物浓度在给药15d后明显上升（表1）。

图3 给药前后OPLS-DA排序检验图

表1 潜在的差异代谢物

3 讨论

本研究基于OPLS-DA分析的UPLC-TOF-MS代谢组学方法从溴鼠灵中毒大鼠尿液中筛选出22个潜在的差异代谢物，并从代谢水平全面表征溴鼠灵中毒后的代谢变化。分析前已将保留时间小于0.5min的色谱峰（接近死时间）排除，因为这些离子受到强烈的离子抑制效应，不能反映真正的浓度差异[14]。本研究构建的OPLS-DA模型R2Y和Q2值均在0.95以上，说明构建的模型具有较高的预测能力。另外本研究还对模型进行排序验证，从模型的参数来看，模型对于解释给药前后尿液代谢组之间差异及寻找差异物质是可靠的，且从排序验证图来看模型不存在“过拟合”现象。OPLS-DA得分图显示，给药前后不同时间的大鼠尿液样本代谢物轨迹在各时间段内相似度较好，呈现各自聚类现象，且随着给药次数增加，尿液代谢物组偏离正常组越远，表明溴鼠灵毒性累积效应。柠檬酸、二氢神经鞘氨醇等大部分差异代谢物在给药15d和给药8d较给药前浓度变化有一致的趋势，且给药次数越多，变化越大。这可能说明溴鼠灵的毒性作用存在累积效应，溴鼠灵给药次数越多，尿液代谢物组偏离正常组越远，产生毒性作用越大。

葡萄糖的有氧氧化是糖氧化的主要方式，也是细胞能量供应的主要来源。葡萄糖循糖酵解途径分解成丙酮酸，丙酮酸进入线粒体再氧化脱羧生成乙酰辅酶A，然后经三羧酸循环转化成柠檬酸、酮戊二酸、苹果酸等系列有机酸，然后为氧化磷酸化反应生成ATP提供还原当量[15，16]。本研究中三羧酸循环中间体柠檬酸、酮戊二酸和苹果酸的减少，表明三羧酸循环受到抑制，而糖酵解途径中丙酮酸的减少或许会进一步抑制三羧酸循环。因此溴鼠灵中毒大鼠尿液中柠檬酸、酮戊二酸、苹果酸和丙酮酸的含量异常或许意味着能量代谢的紊乱参与了溴鼠灵中毒的毒理进程，这与溴鼠灵中毒大鼠血液代谢组研究结果[17]一致。

鞘脂化合物在细胞生长、分化、衰老、信号传导方面起着重要作用[18]。植物鞘氨醇和二氢神经鞘氨醇均属于鞘脂类化合物，在鞘脂生物合成和代谢中具有重要作用[19，20]。本研究中溴鼠灵中毒大鼠尿液中植物鞘氨醇和二氢神经鞘氨醇浓度与给药前相比显著上升（P＜0.05），说明溴鼠灵毒性作用引起鞘脂代谢的紊乱。有研究[17]发现在鞘脂代谢中，鞘磷脂和神经酰胺作为鞘脂代谢的底物可以生成生物活性脂质如鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氢神经鞘氨醇等。由此可知，鞘磷脂和神经酰胺分解代谢的上调可以导致鞘磷脂和神经酰胺储备下降，植物鞘氨醇和二氢神经鞘氨醇在体内富集。

本研究中溴鼠灵中毒大鼠尿液中色氨酸代谢物戊二酸、吲哚酚硫酸和吲哚乙酸浓度异常下降，表明体内色氨酸代谢受到扰动。色氨酸先分解代谢成犬尿氨酸，然后再代谢成戊二酸，或者通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸分解代谢成黄尿酸，前一代谢路径在肾中比在肝中活跃[21]。尿液色氨酸代谢物浓度的降低可能伴随色氨酸浓度的升高，引起氨基酸尿，与肾损伤模型中近曲小管损伤相关联，暗示着肾毒性的发生[22，23]。马尿酸作为苯甲酸和甘氨酸的结合物在肝中形成，其合成可能与肝辅酶A相关，而辅酶A通过肝线粒体中葡萄糖氧化形成，因此生物体液中马尿酸的浓度常常用于肝功能的评估[24]。本研究中马尿酸浓度降低表明溴鼠灵可能引起肝线粒体功能障碍，这与文献[25]报道溴鼠灵诱发肝肾损伤相符，溴鼠灵中毒死亡者肝、肾均可见单核细胞、淋巴细胞与中性粒细胞浸润。

本研究利用基于HPLC-TOF-MS技术的尿液代谢组学方法研究溴鼠灵中毒大鼠的代谢变化，应用OPLS-DA方法筛选出尿液中与溴鼠灵毒性密切相关的22种潜在的差异代谢物，发现溴鼠灵可能通过干预三羧酸循环、糖酵解、鞘脂代谢、色氨酸代谢等代谢途径发挥其全身毒性效应，且从分子水平阐明了溴鼠灵的毒性效应，明确了溴鼠灵毒性作用的累积效应。

[1]Masuda BM，Fisher P，Beaven B.Residue profiles of brodifacoum in coastal marine species following an island rodent eradication[J].Ecotoxicol Environ Saf，2015，113：1-8.

[2]Geduhn A，Esther A，Schenke D，et al.Spatial and temporal exposure patterns in non-target small mammals during brodifacoum rat control[J].Sci Total Environ，2014，496：328-338.

[3]Pitt WC，Berentsen AR，Shiels AB，et al.Non-target species mortality and the measurement of brodifacoum rodenticide residues after a rat（Rattus rattus）eradication on Palmyra Atoll，tropical Pacific[J].Biological Conservation，2015，185：36-46.

[4]Amorena M，Caloni F，Mengozzi G.Epidemiology of intoxications in Italy[J].Vet Res Commun，2004，28（S1）：89-95.

[5]张松，曹峻华，刘文文.血液中杀鼠剂大隆检验1例[J].刑事技术，2014，（5）：63-64.

[6]李力，张珂，雷迅，等.大隆中毒病人血凝指标的动态分析[J].华西医学，2002，17（3）：368-369.

[7]Morgan BW，Tomaszewski C，Rotker I.Spontaneous hemoperitoneum from brodifacoum overdose[J].Am J Emerg Med，1996，14（7）：656-659.

[8]徐燕芬，鲍赛君，蒋美丹.儿童溴鼠灵中毒1例的护理[J].护理与康复，2012，11（9）：902-903.

[9]杨威，徐秀月，吴斌，等.以血尿为首发症状的鼠药中毒误诊2例[J].中国实用乡村医生杂志，2006，13（3）：47-48.

[10]金宝灿，广跃乾，王天昌，等.抗凝血杀鼠剂中毒21例误诊分析[J].贵州医药，2012，36（7）：641-642.

[11]严慧，沈敏.代谢组学在法医毒理学的应用进展[J].法医学杂志，2015，31（3）：219-226.

[12]Robertson DG，Reily MD，Sigler RE，et al.Metabonomics：evaluationofnuclearmagneticresonance（NMR）and pattern recognition technology for rapid in vivo screening of liver and kidney toxicants[J]. Toxicol Sci，2000，57（2）：326-337.

[13]Arfat Y，Mahmood N，Tahir MU，et al.Effect of imidacloprid on hepatotoxicity and nephrotoxicity in male albino mice[J].Toxicology Reports，2014，1：554-561.

[14]Chen J，Wang W，Lv S，et al.Metabonomics study of liver cancer based on ultra performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry with HILIC and RPLC separations[J].Anal Chim Acta，2009，650（1）：3-9.

[15]姚文兵.生物化学[M].第7版.北京：人民卫生出版社，2011：224-230.

[16]Xu HD，Wang JS，Li MH，et al.1H NMR based metabolomics approach to study the toxic effects of herbicide butachlor on goldfish（Carassius auratus）[J]. Aquatic Toxicology，2015，159：69-80.

[17]Yan H，Qiao Z，Shen B，et al.Plasma metabolic profiling analysis of toxicity induced by brodifacoum using metabonomics coupled with multivariate data analysis[J].Forensic Sci Int，2016，267：129-135.

[18]Bourbon NA，Sandirasegarane L，Kester M.Ceramideinduced inhibition of Akt is mediated through protein kinase Czeta：implications for growth arrest[J]. J Biol Chem，2002，277（5）：3286-3292.

[19]Gault CR，Obeid LM，Hannun YA.An overview of sphingolipid metabolism：fromsynthesistobreakdown[J].Adv Exp Med Biol，2010，688：1-23.

[20]Wu S，Chen S，Dong X，et al.Lipidomic profiling reveals significant alterations in lipid biochemistry in hypothyroid rat cerebellum and the therapeutic effects of Sini decoction[J].J Ethnopharmacol，2015，159：262-273.

[21]Allegri G，Costa CV，Bertazzo A，et al.Enzyme activities of tryptophan metabolism along the kynurenine pathway in various species of animals[J].Farmaco，2003，58（9）：829-836.

[22]Lenz EM，Bright J，Knight R，et al.A metabonomicinvestigationofthebiochemicaleffectsof mercuric chloride in the rat using1H NMR and HPLC-TOF/MS：time dependent changes in the urinary profile of endogenous metabolites as a result of nephrotoxicity[J].Analyst，2004，129（6）：535-541.

[23]Williams RE，Major H，Lock EA，et al.D-Serineinduced nephrotoxicity：a HPLC-TOF/MS-based metabonomics approach[J].Toxicology，2005，207（2）：179-190.

[24]Knights KM，Sykes MJ，Miners JO.Amino acid conjugation：contribution to the metabolism and toxicity of xenobiotic carboxylic acids[J].Expert Opin Drug Metab Toxicol，2007，3（2）：159-168.

[25]刘良.生物化学[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2014：190-192.

Evaluation of Brodifacoum-induced Toxicity by Metabonomics Approach Based on HPLC-TOF-MS

YAN Hui,ZHUO Xian-yi,SHEN Bao-hua,XIANG Ping,SHEN Min
（Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,PRC,Shanghai 200063,China）

ObjectiveTo analyse the metabolic changes in urine of rats with brodifacoum intoxication, and to reveal the molecular mechanism of brodifacoum-induced toxicity on rats.MethodsBy establishing a brodifacoum poisoning rats model,the urine metabolic profiling data of rats were acquired using high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry（HPLC-TOF-MS）.The orthogonal partial least squares analysis-discrimination analysis（OPLS-DA）was applied for the multivariate statistics and the discovery of differential metabolites closely related to toxicity of brodifacoum.ResultsOPLS-DA score plot showed that the urinary metabolic at different time points before and after drug administration had good similarity within time period and presented clustering phenomenon.Comparing the urine samples of rats before drug administration with which after drug administration,twenty-two metabolites related to brodifacoum-induced toxicity were selected.ConclusionThe toxic effect of brodifacoum worked by disturbing the metabolic pathways in rats such as tricarboxylic cycle,glycolysis,sphingolipid metabolism and tryptophan metabolism,and the toxicity of brodifacoum is characterized of accumulation effect.The metabonomic method based on urine HPLC-TOF-MS can provide a novel insight into the study on molecular mechanism of brodifacoum-induced toxicity.

forensic toxicology;metabolomics;high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry;brodifacoum;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.007

1004-5619（2017）03-0247-05

2016-04-28）

（本文编辑：刘伟）

“十三五”国家重点研发计划资助项目（2016YFC080 0704）；国家自然科学基金青年科学基金资助项目（81302614）；上海市自然科学基金资助项目（13ZR1443000）；中央级公益性科研院所资助项目（GY2013G-7）；上海市法医学重点实验室资助项目（17DZ2273200）；上海市司法鉴定专业技术服务平台资助项目（16DZ2290900）

严慧（1984—），女，博士，副研究员，主要从事法医毒物学研究；E-mail：yanh@ssfjd.cn

沈敏，女，研究员，博士研究生导师，主要从事法医毒物学研究；E-mail：shenm@ssfjd.cn