副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

侯 魁，丁 轲,1b，刘守业，余祖华，赵战勤

(1.河南科技大学 a.河南省动物疫病与公共卫生重点实验室；b.宏翔生物饲料实验室，河南 洛阳 471023；2.大石桥市高坎动物卫生监督所，辽宁 营口 115112)

副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

侯 魁1a，丁 轲1a,1b，刘守业2，余祖华1a，赵战勤1a

(1.河南科技大学 a.河南省动物疫病与公共卫生重点实验室；b.宏翔生物饲料实验室，河南 洛阳 471023；2.大石桥市高坎动物卫生监督所，辽宁 营口 115112)

为了建立一种简便、快速、灵敏、特异的副猪嗜血杆菌(Hps)检测方法，以Hps的16S rRNA保守区域片段为靶序列，选择6个特异性区域，设计4条特异性引物F3、B3、FIP和BIP。经优化反应体系、检测灵敏性和特异性，建立Hps的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。研究结果表明：该方法的最优反应体系是引物c(F3)∶c(FIP)或c(B3)∶c(BIP)为1∶4、Mg2+浓度为2 mmol/L、dNTPs浓度为6 mmol/L，最低检出量为0.241 pg/μL DNA。该方法灵敏度是PCR法的100倍，且能够特异性检测出Hps，不能检测出猪链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和金黄色葡萄球菌。

副猪嗜血杆菌；16S rRNA；环介导等温扩增；灵敏性；特异性

0 引言

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps)是猪上呼吸道中常在的一种机会致病菌，在特定条件下能够侵入机体，引发以纤维素性多发性关节炎、脑膜炎和浆膜炎为主要特征的全身性疾病[1]。规模化养殖模式使养殖密度增加，病毒性疾病的流行加重了副猪嗜血杆菌的继发感染，导致仔猪死淘率增加、育肥猪生长性能下降，成为患病猪群的重要继发病原之一[2-3]。因此，建立快速准确的诊断方法，及时采取相应的防治措施是控制副猪嗜血杆菌感染的关键。

目前，对副猪嗜血杆菌的检测主要是采用病原的分离与培养、血清学方法和常规的分子生物学方法[3-4]。但因副猪嗜血杆菌营养要求高，分离难度较大，尤其是抗生素的使用加大了副猪嗜血杆菌的分离难度。血清学检测需要昂贵的试剂盒和专用的酶标仪。常规的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法需要昂贵的仪器，不适于副猪嗜血杆菌的临床快速诊断。本文通过比对Hps 16S rRNA序列，获得其高度保守区域，以此为靶基因，针对其6个特异性区域设计4条环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物，通过优化反应体系，验证其灵敏度和特异性，建立了能够快速检测副猪嗜血杆菌的LAMP方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与试剂

副猪嗜血杆菌标准菌株、猪链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、金黄色葡萄球菌等菌株，均由河南科技大学宏翔生物饲料实验室提供并保存。

BstDNA聚合酶大片段购自纽英伦生物技术(北京)有限公司；大豆酪蛋白琼脂培养基(soybean-casein digest agar medium,TSA)和胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)培养基均购自英国OXOID公司；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；Goldview核酸染料和SYBR GreenⅠ核酸凝胶染料均购自北京索莱宝公司；dNTP mixture(25 mmol/L)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；rTaqDNA聚合酶、dNTP mixture(2.5 mmol/L)、10×PCR buffer(Mg2+)等PCR用试剂均购自大连宝生物公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要仪器

电热恒温水浴锅,上海博讯实业有限公司医疗设备厂；基因扩增热循环仪，西安天隆科技有限公司；DYY-10C型电泳仪，北京市六一仪器厂；凝胶成像分析系统，上海天能科技有限公司；双人净化工作台，浙江苏净净化设备有限公司；电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank中已发表的Hps 16S rRNA序列，采用DNAStar 6.0软件确定Hps 16S rRNA的高度保守区域。根据LAMP引物设计的原则，利用Primer Premier 6.0软件，针对其6个特定区域，设计出4条特异性引物F3、B3、FIP和BIP，另设计副猪嗜血杆菌通用PCR引物P1、P2，引物序列见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 Hps基因组的提取

按照天根生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取Hps基因组。

1.2.3 LAMP反应体系的建立及优化

副猪嗜血杆菌LAMP反应的体系为25 μL，其中：10×ThermoPol缓冲液2.5 μL(20 mmol/L Tris-HCL，10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100(pH8.8))；BstDNA聚合酶大片段1 μL；DNA模板2 μL。分别对内外引物浓度比(c(F3)∶c(FIP)或c(B3)∶c(BIP))、Mg2+浓度、dNTPs浓度进行优化，其中：引物浓度比以1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10进行优化；Mg2+以终浓度0 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L进行优化；dNTPs以终浓度0 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L 进行优化。体系在63 ℃恒温水浴锅中保温1 h后，80 ℃高温灭活20 min。反应后取5 μL反应产物，在质量分数为2%的琼脂糖凝胶中电泳20 min，用凝胶成像系统观察优化结果并保存。

1.2.4 LAMP反应的敏感性检测

用核酸测定仪测定Hps基因组的浓度，将原基因组以10倍梯度稀释。以不同浓度的基因组作为模板，分别进行PCR反应和LAMP反应，比较两种反应的灵敏度。PCR反应体系为：0.5 μL rTaqDNA聚合酶、2.5 μL 10×PCR buffer(Mg2+)、2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、上下游引物P1、P2各1 μL，加无菌水至 25 μL。PCR反应的条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.5 LAMP反应的特异性试验

分别以副猪嗜血杆菌、猪链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、金黄色葡萄球菌基因组为模板，按照已建立的LAMP方法对其进行检测，反应结束后加入1 μL SYBR Green Ⅰ核酸凝胶染料混匀，观察颜色变化，各取反应产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，验证所建立检测方法的特异性。判定标准为：反应液经琼脂糖凝胶电泳后，出现梯状条带者为阳性反应，无条带者为阴性反应；向反应液中加入SYBR Green Ⅰ核酸凝胶染料混匀后，呈绿色者为阳性反应，呈橙色者为阴性反应。

2 结果

2.1 LAMP反应体系优化结果

对LAMP法检测Hps分别进行内外引物浓度比(c(F3)∶c(FIP)或c(B3)∶c(BIP))、Mg2+浓度、dNTPs浓度的优化，优化结果见图1～图3。优化结果显示：引物浓度比为1∶4时出现最清晰的条带(见图1)。Mg2+终浓度在2 mmol/L时能够出现典型的梯状条带，终浓度为6 mmol/L时条带最亮，过高的Mg2+浓度会影响电泳结果(见图2)。dNTPs在2 mmol/L即可出现清晰度高、层次分明的梯状条带(见图3)。

M.DL 2000 DNA Marker；1～6.引物浓度比分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10；7.阴性对照。 图1 LAMP反应引物浓度比优化结果

2.2 PCR法和LAMP法敏感性检测结果

对Hps基因组进行10n倍(n=0,1,…,8)稀释后，分别进行PCR和LAMP反应，通过比对检测其敏感性，检测结果见图4。图4a显示PCR法最低可以检测到10-4倍的模板量，而图4b显示LAMP法最低可以检测到10-6倍的模板量，是PCR法灵敏度的100倍。用核酸测定仪检测到原模板的DNA质量浓度为241 ng/μL，计算得LAMP法检测Hps的DNA最低检出量为0.241 pg/μL。

M.DL2000DNAMarker;1～6.Mg2+终浓度分别为0mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L;7.阴性对照。图2 LAMP反应Mg2+终浓度优化结果 M.DL2000DNAMarker;1～6.dNTPs终浓度分别为0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L;7.阴性对照。图3 LAMP反应dNTPs终浓度优化结果

(a) PCR法敏感性检测结果(b) LAMP法敏感性检测结果M.DL2000DNAMarker;1～9.模板稀释倍数分别为100、101、102、103、104、105、106、107、108倍;10.阴性对照。

图4 PCR法和LAMP法敏感性检测结果

2.3 LAMP法特异性检测结果

利用本文所建立的方法，分别对副猪嗜血杆菌、猪链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和金黄色葡萄球菌进行检测，检测结果如图5所示。由图5可知：仅在以副猪嗜血杆菌为模板时结果显示有梯状条带，电泳呈阳性；且加入SYBR Green Ⅰ 核酸凝胶染料后仅副猪嗜血杆菌反应液呈绿色，为阳性反应，其他菌株反应液呈橙色，为阴性反应，表明所建立的LAMP方法具有良好的特异性。

3 讨论

副猪嗜血杆菌在培养过程中对营养和环境要求较高，从病料中分离率极低，一般条件下难以对其进行分离培养，且菌种保藏要求苛刻，甘油生理盐水保藏15 d后存活率仅为1.3%[5]。最常用的琼脂扩散试验、间接血凝试验等血清学诊断方法操作繁琐，检测所需时间长，且特异性和灵敏性较低[6]。PCR检测方法虽然特异性强、灵敏度高，但是需要昂贵的PCR仪，不适合临床及基层推广使用。本文基于Hps 16S rRNA特异性片段设计引物，利用LAMP法检测副猪嗜血杆菌，克服了这些缺点，其灵敏度是PCR法的100倍，DNA最低检出量为0.241 pg/μL，反应过程均在水浴锅内完成，操作简便，非常适合基层及现场的快速诊断，为LAMP的基层推广以及副猪嗜血杆菌的临床诊断提供了重要的理论依据。与文献[7-8]相比，本文所得到的试验结果具有更加清晰的梯状条带，且各梯度之间差异显著，能够更加直观地体现最佳反应条件，确保所建立体系的准确性。

M.DL 2000 DNA Maker；1～7.模板分别为副猪嗜血杆菌、猪链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、金黄色葡萄球菌；8.阴性对照。图5 LAMP法特异性检测结果

LAMP技术自2000年由文献[9]报道以后就吸引了世界各个领域的科研人员，目前LAMP技术已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等的检测中，包括沙门氏菌、霍乱弧菌、乙型肝炎病毒、日本血吸虫等[10-13]。而且，由于LAMP技术高特异性和高灵敏性的特点，科研人员将多种技术与LAMP技术结合，开发出新型LAMP技术用于生物学检测。文献[14]利用RT-LAMP技术快速检测H1N1流感病毒。文献[15]将LAMP和原位杂交相结合，建立Situ-LAMP技术，用于检测组织细胞中携带stx2基因的细菌。LAMP技术研究前景广阔，但研究中发现LAMP技术也存在很多不足之处，如LAMP反应的靶序列一般在300 bp以下，且内引物终浓度较高，所以LAMP引物的设计和筛选工作相当繁琐，这也增大了其多重扩增的难度。另外，LAMP反应灵敏度较高，在试验过程中极易出现假阳性，因此应严格区分试剂存放区、加样区和检测区，试验器材应严格消毒，并且要避免无关人员流动，在无菌操作台内完成加样工作，一旦发现污染，应暂时停止试验、保持室内通风并更换所有试剂。

4 结论

建立了副猪嗜血杆菌的LAMP 检测方法，确定了LAMP最佳反应体系：内外引物浓度比c(F3)∶c(FIP)或c(B3)∶c(BIP)为1∶4，Mg2+终浓度为6 mmol/L，dNTPs终浓度为2 mmol/L，加入10×ThermoPol缓冲液2.5 μL、BstDNA聚合酶大片段1 μL以及适量DNA模板，加无菌水至25 μL。在63 ℃水浴锅中保温1 h，然后80 ℃高温灭活20 min即可完成反应。该方法检测副猪嗜血杆菌的最低检出量为0.241 pg/μL DNA。反应产物加入1 μL SYBR GreenⅠ核酸凝胶染料变为绿色或电泳结果出现梯状条带为阳性，反应产物加入1 μL SYBR GreenⅠ核酸凝胶染料变为橙色或电泳结果没有出现梯状条带为阴性。

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国家“十三五”重点研发计划基金项目(2016YFD0500700)

侯魁(1991-)，男，河南三门峡人，硕士生;丁轲(1977-)，男，通信作者，河南永城人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事动物微生态与动物传染病方面的研究.

2017-03-02

1672-6871(2017)06-0059-04

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.06.012

S852.659.2

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