荞麦花叶发酵提取物对2型糖尿病db/db小鼠心肌损伤的影响

王建行，王 妍，刘 曼，穆 玉，张 博，韩淑英

(1.华北理工大学冀唐学院医学实验中心；2.华北理工大学基础医学院药理学系；3.河北省慢性疾病重点实验室及唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北 唐山 063000)

◇中药药理学◇

荞麦花叶发酵提取物对2型糖尿病db/db小鼠心肌损伤的影响

王建行1，王 妍1，刘 曼1，穆 玉1，张 博1，韩淑英2,3

(1.华北理工大学冀唐学院医学实验中心；2.华北理工大学基础医学院药理学系；3.河北省慢性疾病重点实验室及唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北 唐山 063000)

目的 探讨荞麦花叶发酵提取物(EFBFL)对自发肥胖2型糖尿病db/db小鼠心肌损伤的保护作用及其可能的机制。方法 9周龄♂ db/db小鼠随机分为EFBFL高(EFBFL-H, 0.1 g·kg-1)、低(EFBFL-L, 0.05 g·kg-1)剂量组，二甲双胍对照组，模型对照组，每组10只。同时以10只db/m小鼠为正常对照组。各组均每天灌胃给药 1次，连续8周。于给药前及给药后第2、4、6、8周末检测小鼠随机血糖(RBG)，8周后处死取血清检测肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和糖基化终末代谢产物(AGEs)含量；HE染色光镜下观察心肌组织形态学改变，电镜下观察心肌超微结构；免疫组化法和Western blot法检测心肌组织葡萄糖转运蛋白4( Glut4)表达。结果 EFBFL能有效抑制db/db小鼠心肌细胞损伤及心肌纤维化的病理进程，降低小鼠血糖及血清中CK、CK-MB、 AGEs的含量，增加小鼠心肌组织Glut4 蛋白表达水平。结论 EFBFL对自发肥胖2型糖尿病db/db小鼠心肌损伤具有抑制作用，其机制可能与降低小鼠血糖、抑制 AGEs的产生及促进心肌细胞Glut4蛋白的表达有关。

荞麦花叶发酵提取物；2型糖尿病；糖尿病性心脏病；心肌损伤；db/db小鼠；葡萄糖转运蛋白4

糖尿病(diabetes mellitus, DM)已成为严重危害人类健康的疾病之一，由DM导致的器官损害和并发症严重的威胁着人类的生命。糖尿病性心脏病(diabetic cardiopathy, DC)是DM所引发的严重的心血管并发症，亦是DM病人致死致残的主要原因之一。DM增加心血管疾病危险性的具体机制目前尚不清楚，但葡萄糖代谢紊乱是DC的共同特征和主要发病机制。因此，寻找安全、有效控制DC的药物，已成为研究的焦点。

前期研究发现，从荞麦花叶中提取的黄酮具有降糖、降脂、扩张血管、改善微循环、抗氧化等作用[1-2]，并对实验性DM大鼠心脏具有一定的保护作用[3]。近期对荞麦花叶进行酵母菌发酵处理，发现其黄酮含量有所降低，表明微生物发酵后成分有所改变，但其药理活性是否改变或增强尚未知。因此，本实验是在前期研究的基础上，观察荞麦花叶发酵提取物(extract from fermented buckwheat flower and leaf, EFBFL)对自发肥胖2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM) db/db小鼠的心肌损伤是否具有抑制作用，并进一步探讨其抑制心肌损伤的机制，为荞麦花叶进一步开发利用提供依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 SPF级自发肥胖T2DM db/db小鼠55只，♂，体质量(35±5)g， 7～8周，购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(苏)2001-0003。SPF级db/m小鼠，♂，体质量(20±2)g， 7～8周；购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号： SCXK(苏)2001-0003。60Co辐射小鼠颗粒饲料，南京贝斯弗饲料有限公司，生产批号：20151030001MF01。小鼠均于华北理工大学实验动物中心屏障实验室饲养与实验。

1.2 主要药品与试剂 盐酸二甲双胍(批号：1504025，天津亚宝药业科技有限公司)。安琪高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术，批号：12251516 0426)，RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司，批号：20160104)，小鼠 Glut4 单克隆抗体(Abcam 公司，货号：ab115831)，Western blot用兔抗鼠多抗(Abcam公司产品，货号：ab150073)， PVDF 膜(Milipore型号K5EA5857D，批号：K5EA5857D)，糖基化终产物(AGEs)ELISA试剂(北京凯诺春天生物科技有限公司，批号：2015120A)。EFBFL的制备：将活化增殖的酵母菌液加入干燥的荞麦花叶粉末中，给予蛋白胨和葡萄糖营养，置37℃恒温箱中培养48 h，用70%乙醇回流提取2 h，离心取上清液，合并滤液，70℃浓缩干燥，即得荞麦花叶发酵醇提物(EFBFL)。

1.3 仪器与设备 安妥血糖仪及血糖试纸(美国雅培公司)；日立7150 全自动生化分析仪(日本日立公司)；MP200A 型电子天平(上海第二天平仪器厂)；真彩病理图像分析系统(型号HMIAS-2000，高腾科技有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；MV-Ⅱ型双垂直板式电泳槽( 大连竞迈生物科技有限公司) ；凝胶成像分析系统(Universal Hood Ⅲ，美国伯乐US Bole)；高速低温离心机(德国Eppendorf公司，型号：5180R)；多功能酶标仪(200PRO，瑞士帝肯有限责任公司)，高倍显微镜(OLYMPUS BX50)，石蜡切片机(德国Leica RM2145)，透视电镜(日本日立公司)

1.4 实验动物分组与给药 db/db小鼠适应性饲养1周后，剪尾法取血，用血糖仪测定随机血糖，筛选出随机血糖(RBG)≥16.7 mmol·L-1的实验用鼠40只，再按体质量、血糖分层，随机分为4组，每组10只，即模型对照组(MC组)：灌胃蒸馏水；EFBFL干预组：分别灌胃EFBFL低、高两个剂量组(EFBFL-L：0.05 g·kg-1、EFBFL-H：0.1 g·kg-1)；二甲双胍组(Met组)：灌胃二甲双胍0.16 g·kg-1；正常对照组(NC组)：灌胃蒸馏水。各组均每天灌胃1次，连续给药8周。

1.5 检测指标

1.5.1 随机血糖的测定 分别于给药第0、2、4、6、8周末检测随机血糖(RBG)1次(给药后30 min)。

1.5.2 血清心肌酶与糖基化终末代谢产物测定 给药8周后，禁食12 h，摘眼球取血，分离血清，-20℃冻存。采用酶联免疫吸附法测定血清糖基化终末代谢产物(AGEs)含量，按试剂盒说明书操作；用全自动生化分析仪测定血清中肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性。

1.5.3 心脏组织形态学检测 取左室心尖部剪成1 mm3大小，2.5%戊二醛固定4 h，1%锇酸固定1 h，乙醇逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片(片厚70 nm)，枸橼酸铅染色，在透射电镜下观察超微结构变化；余心脏组织放入4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、片厚4 μm ，HE染色，光镜下观察心肌组织形态学变化。

1.5.4 免疫组化法检测心肌组织葡萄糖转运蛋白4的表达 石蜡包埋的心肌组织连续切片(5 μm)，经脱蜡至水、抗原修复后，加1 ∶100稀释的一抗4℃过夜，PBS洗3次，加二抗37℃ 60 min，PBS洗3次，DAB显色，自来水终止显色，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS 替代一抗作为阴性对照，在光镜下观察葡萄糖转运蛋白(Glut4)表达分布(细胞胞膜和胞质内棕黄色颗粒即为阳性信号)情况。将每张切片在200倍光学显微镜下观察，用 Image-Pro Plus6.0图像处理系统测量Glut4的平均积分吸光度。

1.5.5 Western blot法检测心肌组织葡萄糖转运蛋白4的表达 取心肌组织在裂解液中制成匀浆，离心后取上清液，采用BCA方法测定总蛋白浓度。上样前加入5×buffer，100 μg蛋白样品经电泳分离后电转至PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h后，孵育一抗Glut4(1 ∶1 000)4℃缓慢振荡过夜。次日TBST漂洗滤膜5 min×3次，孵育二抗Goat anti-Rabbit IgG/HRP(1 ∶5 000)稀释，37℃室温振荡孵育1 h，TBST漂洗5 min×3次，加入超敏ECL化学发光试剂，暗室曝光。采用Image J软件进行灰度分析，以GAPDH为内参，结果用目的蛋白与GAPDH的比值表示其相对含量。

2 结果

2.1 EFBFL对db/db小鼠RBG的影响 在治疗期间，NC组小鼠血糖无明显变化；与NC组比，MC组RBG明显升高(P<0.01)；与MC组比，Met组、EFBFL干预组均能明显地降低db/db小鼠的RBG值(P<0.05，P<0.01),且EFBFL-H组与Met组差异没有统计学意义(P>0.05)。见Tab 1。

2.2 EFBFL对db/db小鼠血清CK、CK-MB和AGEs的影响 与NC组比，MC组血清中CK、CK-MB、AGEs含量均明显升高(P<0.05，P<0.01)；EFBFL干预组血清中CK、CK-MB、AGEs含量有不同程度降低，与MC组比较，差异存在统计学意义，尤以EFBFL-H组效果最为明显(P<0.05)，且EFBFL-H组与Met组差异没有统计学意义(P>0.05)。见Tab 2。

2.3 EFBFL对db/db小鼠心肌形态结构的影响

2.3.1 各组小鼠心肌组织光镜下形态学观察

Tab 1 Effects of EFBFL on random blood glucose in db/db mice(±s，n=10)mmol·L-1

**P<0.01vsNC；#P<0.05，##P<0.01vsMC

Tab 2 Effects of EFBFL on serum CK, CK-MB and AGEs levels in db/db mice(±s，n=10)

*P<0.05，**P<0.01vsNC；#P<0.05，##P<0.01vsMC

HE染色结果显示，光镜下可见NC组db/m小鼠心肌细胞形态完整，结构无明显的改变，无细胞变性坏死、炎性细胞浸润和间质纤维化；MC组db/db小鼠心肌细胞明显肿胀肥大，核明显增大，心肌纤维排列紊乱，心肌纤维有局灶性坏死，可见炎性细胞浸润。Met和EFBFL干预组小鼠心肌组织结构改变明显减轻，细胞形态较完整，边界较清楚，心肌细胞排列紊乱、心肌细胞肿胀及炎性细胞浸润减轻，特别是EFBFL-H组心肌结构基本正常,(Fig 1)。

2.3.2 各组小鼠电镜下心肌细胞超微结构的观察 电镜下观察，NC组db/m小鼠心肌细胞中，粗肌丝排列整齐，明暗带清晰可见，线粒体丰富且结构清晰，嵴密集排列。MC组db/db小鼠可见心肌细胞中线粒体肿胀、变性，呈空泡化肌丝灶性溶解、变性，嵴断裂、稀疏；肌原纤维间水肿明显，排列不整齐，肌细胞中可见到糖原和脂滴沉着，可见小肌溶解灶及脂褐素及胶原纤维增生；Met组、EFBFL干预组db/db小鼠均可见线粒体病变减轻，偶见线粒体空泡样变；肌丝排列趋于正常，明暗带较清晰，嵴断裂现象减少、排列较密集。EFBFL-H组和Met组上述心肌超微结构改善更明显，二者相近(Fig 2)。

2.4 免疫组化法检测db/db小鼠心肌Glut4蛋白的表达 由Fig 3可见，NC组db/m小鼠心肌组织Glut4高表达，棕黄色染色均匀分布在细胞质及细胞膜上，表达蛋白染色呈深棕色，点状，细胞核内阳性染色不明显；MC组低表达，阳性染色颗粒数量减少，分布不均匀，颜色呈浅黄色；而EFBFL干预组Glut4表达均明显升高，阳性染色颗粒数量较MC组明显增多，颜色较MC组明显加深，其中EFBFL-H组升高最为明显。用 Image-Pro Plus 6.0图像处理系统分别测量每张切片Glut4的平均积分吸光度，结果如下：与NC 组相比，Glut4的表达在MC 组中明显降低(P<0.01)；与MC 组相比， EFBFL干预组Glut4的表达明显升高(P<0.01)，其中EFBFL-H组蛋白表达最高，且与NC 组差异无统计学意义(P>0.05)。

Fig 1 Morphologic structure of myocardial tissues by HE staining in db/db mice(×200)

A:NC；B:MC；C:Met；D:EFBFL-H；E:EFBFL-L

Fig 2 Ultrastructure of myocardial tissues by electronic microscope

A:NC；B:MC；C:Met；D:EFBFL-H；E:EFBFL-L

Fig 3 Immunohistochemistry of Glut4 protein expression in myocardium of db/db mice(±s，n=10)

A:NC；B:MC；C:Met；D:EFBFL-H；E:EFBFL-L;F:Bar graph of semi-quantitative result of immunohistochemistry.**P<0.01vsNC；##P<0.01vsMC

Fig 4 Western blot of Glut4 in myocardium

**P<0.01vsNC；#P<0.05，##P<0.01vsMC

2.5 Western blot法检测心肌Glut4蛋白的表达 Western blot结果见Fig 4，GAPDH作为内参，在各组中有较均一的表达；Glut4在各组中的蛋白条带深浅不一。

用Image J图像处理系统测出各组Glut4、GAPDH蛋白表达量，并计算其比值。与NC组相比，MC组Glut4表达水平明显降低(P<0.01)；EFBFL-H组Glut4表达水平明显升高，与MC组比较存在统计学意义(P<0.01)，且与NC组差异无统计学意义(P>0.05)。与免疫组化结果一致。

3 讨论

DM作为一种代谢性疾病，可引起心肌细胞代谢及结构紊乱，导致心肌细胞坏死及组织纤维化，最终使心肌收缩、舒张功能发生障碍[4]，从而引发DC。流行病学研究发现，80%的DM患者死于心血管并发症，其心血管疾病及心力衰竭的发病率较非DM者高2～3倍[5]。荞麦作为药食同源的本草植物，近年来倍受人们关注。前期研究发现荞麦花叶黄酮具有降血糖、调血脂、增加胰岛素敏感性、抗氧化等作用[1-2]，并对实验性DM大鼠心脏具有一定的保护作用[3]。近期研究[6]发现荞麦花叶发酵后总黄酮含量降低，但对链脲佐菌素DM大鼠模型有降糖作用。本实验在前期研究的基础上进一步探讨EFBFL对自发肥胖T2DM db/db小鼠的心肌损伤是否具有抑制作用，并探讨其抑制心肌损伤的机制。

本实验采用自发肥胖T2DM db/db小鼠为研究对象，其特点是由于瘦素受体缺陷，影响下丘脑对进食的调节障碍，导致小鼠在 4 周龄左右发生肥胖，8周龄左右开始出现严重高血糖；同时，db/db小鼠具有高胰岛素血症、高脂血症、心肌肥大等特点，能较好反映出DC的病理特点[7]。

高血糖作为一个独立的危险因素，是DC发生和发展的始动因素[8]，持续的高血糖状态会抑制心肌葡萄糖氧化利用，促进脂肪酸的氧化，最终导致心肌受损[9-10]，加重DC。本实验结果显示， EFBFL可明显降低db/db小鼠的RBG值，表明EFBFL可有效控制db/db小鼠的血糖，促进心肌葡萄糖的氧化利用，改善糖代谢紊乱。

CK、CK-MB是一种心肌较特异性酶，被认为是心肌损伤的重要标志物[11]。通过检测血清CK、CK-MB 的水平可以反映心肌损伤的严重程度，其升高幅度与心肌损伤的严重程度呈正相关。本实验结果显示，与NC组比，MC组血清中CK、CK-MB含量明显升高；EFBFL干预组血清中CK、CK-MB含量有不同程度降低，尤以EFBFL-H组效果最为明显。表明EFBFL 对db/db小鼠心肌损伤有一定的抑制作用。

高血糖环境下AGEs产生增多，作用于全身血管，导致微血管与大血管病变继而引发代谢性损伤[12]。AGEs是一种不可逆的大分子产物，一旦在高糖环境下形成，此后再严格控制血糖，也无法阻止 AGEs 交联过程的继续进行[13]。所以抑制AGEs的生成对治疗DM并发症有重要意义。已有研究证实[14]，抑制AGEs可有效改善心肌功能。与此同时，高血糖环境下心肌出现能量代谢紊乱，使心肌发生变性、坏死、纤维化及微血管病，心肌细胞会出现线粒体肿胀、破裂，肌原纤维溶解及间质纤维化[15]。本实验结果显示， EFBFL可明显降低db/db小鼠血清中AGEs的含量，且通过本实验心肌组织形态学研究发现， EFBFL能有效的保护db/db小鼠心肌细胞形态完整，使心肌结构基本正常，减轻了肌原纤维的不规则排列及间质纤维化，线粒体结构明显改善，线粒体数量增多，肿胀明显减轻。表明EFBFL可以抑制血清中 AGEs的生成，减轻AGEs对心脏血管的损伤，抑制心肌细胞损伤及心肌纤维化，有效改善心肌功能。

Glut4是胰岛素敏感的反应性葡萄糖转运体，是细胞信号转导通路的开关。Glut4是心肌细胞质膜转运葡萄糖的重要物质，且心肌细胞摄取的葡萄糖量与心肌细胞质膜的Glut4数量密切相关[16]。有研究显示Glut4表达失常会导致胰岛素抵抗，心肌细胞对葡萄糖的摄取和利用减少，引起心脏能量代谢障碍，糖代谢低下，从而导致心脏结构和功能受损；而Glut4过多表达可以明显改善DM症状[17]。本研究结果表明，EFBFL可明显升高db/db小鼠心肌组织中Glut4的蛋白表达水平。通过EFBFL治疗可上调Glut4表达。心肌组织葡萄糖摄取、利用明显增加，从而降低血糖。增加Glut4蛋白表达不仅可以增加心肌组织胰岛素敏感性，而且促进心肌能量向葡萄糖代谢转移，从而改善心肌糖代谢异常，抑制心肌损伤。

综上所述，EFBFL具有改善db/db小鼠的糖代谢紊乱、增加胰岛素敏感性，减轻心肌细胞损伤及心肌纤维化的作用。其机制可能是通过改善小鼠心肌组织内Glut4蛋白表达障碍，促进葡萄糖的摄取，从而降低血糖，增加心肌组织对胰岛素的敏感性；此外，EFBFL还可以减轻血清中AGEs含量，阻止 AGEs 对心脏血管的损害，对db/db小鼠心脏的损伤具有抑制作用。本研究为荞麦花叶的深入研究提供了新的思路，为荞麦花叶的开发再利用提供了新的研究方向。

(致谢：本实验是在华北理工大学实验动物中心、华北理工大学基础医学院、河北省慢性疾病重点实验室及唐山市慢性病临床基础研究重点实验室完成的，向在实验过程中给予帮助和支持的老师表示衷心感谢！)

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Effects of extract from fermented buckwheat flower and leaf(EFBFL)on myocardial injury in type 2 diabetic db/db mice

WANG Jian-xing1,WANG Yan1,LIU Man1,MU Yu1,ZHANG Bo1,HAN Shu-ying2,3
(1.SchoolofJitang; 2.SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology;3.HebeiKeyLabonChronicDiseasesandTangshanBasicClinicalResearchKeyLabonChronicDiseases,TangshanHebei063000,China)

Aim To discuss the effectsof extract from fermented buckwheat flower and leaf(EFBFL) on myocardial injury in spontaneously obese type Ⅱ diabetic db/db mice and its mechanism.Methods 9-week-old male db/db mice were randomly divided into high level EFBFL dose group(EFBFL-H, 0.1 g·kg-1), low level EFBFL dose group(EFBFL-L, 0.05 g·kg-1),metformin hydrochloridecontrol group, model control group, and normal control group, with 10 mice in each group. All groups were treated with 8 wks of drugs by gastric perfusion. The random blood glucose(RBG) was tested respectively at the end of 2nd, 4th, 6th, and 8th wk. Finally, the levels of creatine kinase(CK) creatine kinase MB(CK-MB), andadvanced glycosylation endproducts(AGEs) were detected after 8 wks. The morphological changes of myocardium were observed under light microscope by HE staining, and the ultrastructure of myocardium was observed under electron microscope. Immunohistochemical method and Western blot were used to detect myocardial tissue glucose transporter-4(Glut-4).Results EFBFLcould repress patho-proceeding of myocardial fibrosis efficiently, and significantly decrease the level of blood glucose, CK,CK-MB, and AGEs in db/db mice. Meanwhile, it could increase the expression of Glut-4 in myocardial tissues of mice.Conclusions EFBFL can prevent myocardial injury in spontaneously obese type Ⅱ diabetic db/db mice. The possible mechanism may be related to lowering the level of blood glucose and serum AGEs and up-regulating Glut4of cardiac muscle.

extract from fermented buckwheat flower and leaf; type 2 diabetes mellitus; diabetic cardiopathy; myocardial injury; db/db mice; Glut-4

2017-04-17，

2017-05-18

河北省自然科学基金资助项目(No C2010001795)；河北省中医药管理局科研计划项目(No 2017083)

王建行(1983-)，女，硕士，讲师，研究方向：中药防治糖尿病和心血管疾病，E-mail: wangjianxing-83@163.com； 韩淑英(1959-)，女，硕士，教授，硕士生导师，研究方向：中药防治糖尿病和心血管疾病，通讯作者，E-mail:shuyinghan59@126.com

时间：2017-6-7 19:04 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.054.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.027

A

1001-1978(2017)07-1026-06

R-332；R284.1；R322.11；R542.2；R587.1；R977.6