Cx43对脑胶质瘤C6细胞增殖的影响及机制

李业如，庞祥媚，李 敏， 王 清，杨宇清，韩小建， 蒋丽萍

(南昌大学药学院药理学教研室，江西 南昌 330006)

Cx43对脑胶质瘤C6细胞增殖的影响及机制

李业如，庞祥媚，李 敏， 王 清，杨宇清，韩小建， 蒋丽萍

(南昌大学药学院药理学教研室，江西 南昌 330006)

目的 将pCMV-Cx43cDNA重组质粒转染入大鼠脑胶质瘤C6细胞，上调C6细胞Cx43表达，进而探讨C6细胞Cx43过表达对其增殖能力的影响及机制。方法 通过脂质体将pCMV-Cx43cDNA重组质粒转入C6细胞，使C6细胞过表达Cx43，并用G418筛选出稳定过表达Cx43的C6细胞；测定细胞倍增时间和软琼脂集落形成实验，检测各组细胞的增殖程度；分别用ERK1/2特异性阻断剂PD98059(30 μmol·L-1)、p38MAPK特异性阻断剂SB20219(10 μmol·L-1)处理各组细胞，Western blot检测各组细胞Cx43、p-Cx43、p-ERK1/2和p-p38MAPK的表达；MTT比色法检测各组细胞活性。结果 成功将pCMV-Cx43cDNA重组质粒转入C6细胞，并筛选出稳定转染Cx43基因的C6细胞；测定细胞倍增时间和软琼脂集落形成实验表明C6-Cx43组比C6组、C6-pCMV组细胞增殖速度减慢，细胞集落数明显减少(P<0.01)；ERK1/2、p38MAPK特异性阻断剂处理细胞后，Western blot检测发现C6-Cx43+PD98059组、C6-Cx43+SB202190组较C6-Cx43组Cx43表达升高(P<0.01)、p-Cx43(P<0.05)表达下调。结论 阻断ERK1/2、p38MAPK通路，导致Cx43 蛋白表达升高，从而抑制C6细胞的增殖。

脑胶质瘤C6细胞；缝隙连接；Cx43；增殖；ERK1/2；p38MAPK

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤，约占颅内各类型肿瘤发生率的0.4～0.6。目前，治疗脑胶质瘤的主要手段是行肿瘤切除术，其次是放疗和化疗。由于肿块的不均一性、肿块与正常组织结合在一起无界限及胶质瘤细胞的高侵袭性，使得预后不良，术后易复发。因此，迫切需要探索新的观念和方法、新的分子靶点来治疗脑胶质瘤。

缝隙连接(gap junction,GJ)通道是相邻两细胞通过连接子两两对接而成，生理条件下，允许细胞间电流、离子、分子质量小于1.2 ku、直径小于10 nm的分子及第二信使物质通过[1]。Cx43是中枢神经系统表达最丰富的缝隙连接通道蛋白(connexins,Cxs)，且主要分布在星型胶质细胞中。已有研究表明，Cx43是一种肿瘤抑制基因，可以扭转乳腺癌、神经胶质瘤细胞等癌细胞的表型转化。尽管Cx43表达水平的变化不是脑胶质瘤的始动因素，但Cx43表达水平与神经胶质瘤病理类型及恶性程度有关。Herrero-Gonzalez等[2]研究表明，Cx43能够抑制脑胶质瘤C6细胞中c-Src致癌活性，从而进一步降低C6细胞增殖率。此外，洪涛等[3]发现，转染Cx43 cDNA可明显抑制C6细胞增殖，且导致缝隙连接通讯功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)增强。上述研究均证明Cx43参与肿瘤细胞增殖、迁移和黏附，所以Cx43成为治疗脑胶质瘤的一个潜在重要靶点。细胞因子能维持肿瘤细胞的快速生长，促进其播散转移，从而使肿瘤细胞不断增殖、转移侵袭入体正常组织。由于基因的突变，大部分肿瘤细胞都过表达EGF、IGF、PDGF等生长因子和其受体，这些因子的信号主要通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路传导到细胞核引起细胞过增殖反应。MAPK是一类重要的细胞内信息传递物质，参与细胞的增殖、分化和凋亡等生理、病理过程。大量的研究表明MAPK可将膜受体刺激信号传递入细胞核内靶部位，调节细胞基因转录和蛋白合成，它是许多胞外促细胞增殖信号传导通路的核心环节[4]。其中ERK1/2通路在生长因子相关的刺激引起的细胞增殖反应中起着重要的作用，而p38MAPK通路主要受紫外线、过氧化氢和促炎细胞因子等损伤性因素的激活和调节，参与应激反应[5]。Cx43对肿瘤细胞快速增殖的影响与MAPK信号通路是否密切相关尚不清楚，因此在前人研究的基础上，本实验通过转染Cx43cDNA介导C6细胞过表达Cx43，探讨C6细胞过表达Cx43与其增殖关系及可能的机制，为临床防治脑胶质瘤提供新的思路和策略。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠C6细胞(中山大学生物实验中心卢慧敏博士后惠赠)，pcDNA3.1 质粒(南昌大学分子生物中心惠赠)，pCMV-cx43cDNA重组质粒(本实验构建)。胎牛血清、DMEM、Lipofectamine 2000、G418(美国Gibco公司)，MTT(北京天根公司)，兔抗Cx43、p-Cx43、ERK1/2、p-ERK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)，山羊抗兔IgG(北京康为世纪生物科技有限公司)、明胶(西安国安生物科技有限公司)，其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒及空载质粒转染C6细胞并筛选稳定细胞株

1.2.1.1 G418药物最优浓度筛选 将细胞以1×106·L-1，接种到24孔板。接种后d 2按G418(0、50、100、200、400、800、1 000 mg·L-1)进行筛选。每3 d更换1次含相同浓度G418的新鲜培养基，观察细胞生长及死亡情况，以孔中细胞全部死亡的最低G418浓度为筛选剂量。本实验筛选出G418最优浓度为800 mg·L-1。

1.2.1.2 筛选稳转细胞株 将细胞以5×107个·L-1接种到6孔板，培养24 h进行转染。配制溶液a：240 μL无血清培养基+10 μL Lipofectamine 2000，总体积250 μL，室温孵育5 min。溶液b：每孔加220 μL无血清培养基+30 μL质粒(130 mg·L-1)，总体积250 μL。将溶液a与b充分混合，室温孵育20 min。将6孔板中的细胞用PBS冲洗2遍，加入2 mL无血清培养基，再加入溶液a与b的混合液500 μL，边加边摇动培养板混匀。6 h后，更换含体积分数为0.1 FBS的DMEM培养基培养48 h，更换含G418(800 mg·L-1)的DMEM培养液进行筛选。每隔3 d换用新鲜的含G418培养基，以替换含大量死细胞的培养基。待抗性细胞长满后，传代培养并冻存保种。

1.2.2 Western blot检测细胞内蛋白表达 用BCA法进行总蛋白定量，在保证蛋白上样量一致的情况下，进行SDS-PAGE后，转移到PVDF膜上，用体积分数为0.05的脱脂牛奶室温封闭1 h，4℃孵育一抗过夜，以及室温孵育二抗1 h，使用ECL发光液在凝胶成像系统照相并记录，Image J软件分析条带灰度值。

1.2.3 细胞倍增时间测定 收集各组细胞，经胰酶消化离心后，用含体积分数0.001的BSA DMEM培养液重悬细胞，以5×107个·L-1接种到6孔板，每组设5个复孔，放在体积分数0.05的CO2，37℃培养箱中培养。分别于培养24、48、72 h后胰酶消化离心，用体积分数0.001的BSA DMEM培养基重悬各组细胞，从每组细胞悬液中吸取20 μL滴入细胞计数板进行计数，并计算各组细胞倍增时间。细胞倍增时间计算公式为：Td=T×lg2/lg(N/N0)。Td：倍增时间、T：间隔时间、N：终点细胞数量、N0：初始细胞数量。

1.2.4 细胞的软琼脂集落培养实验 收集各组细胞，胰酶消化后吹散成单细胞悬液，计数并调节细胞浓度为5×107·L-1。取6孔板，将体积分数0.012的琼脂糖(在65℃水浴中放置保持融化状态)与2×细胞培养基以1 ∶1的体积比混合制备成体积分数0.006的底层琼脂，每孔迅速加入1.4 mL，室温凝固。将体积分数0.006的琼脂糖与2×细胞培养基以1 ∶1的体积比混合，制备体积分数为0.003的上层琼脂，每孔加1 mL上层琼脂和100 μL单细胞悬液(约1 000个/孔)，混匀，室温凝固。置于体积分数为0.05的CO2，37℃培养箱中培养2周。

1.2.5 MTT比色法测定细胞活性 收集各组细胞，消化离心重悬，以3×106·L-1接种到96孔板，每组设5个复孔，放在体积分数为0.05的CO2，37℃培养箱中培养。分别于培养24、48、72 h后每孔分别加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1，0.005 MTT)，并继续培养4 h。取出96孔板，每孔加100 μL DMSO，轻轻震荡混匀，用全自动酶标仪在570 nm波长下测量光吸度值。

2 结果

2.1 Western blot检测重组质粒稳定转染C6细胞后Cx43蛋白表达水平 采用Lipofectamine 2000将重组质粒稳定转染至C6细胞，Western blot检测Cx43表达水平。如Fig 1所示：C6-Cx43组与C6组相比，Cx43表达明显升高(P<0.01)，C6-pCMV组与C6相比，差异无统计学意义(P>0.05)，表明成功将重组质粒转入C6细胞并稳定表达Cx43。

2.2 体外培养测定各组细胞倍增时间 通过绘制细胞生长曲线，反映各组细胞增殖速度。经计算，3组细胞的倍增时间分别为28.5、29.4、70.3 h。如Fig 2所示，C6-Cx43组细胞倍增时间较C6组明显延长(P<0.01)，而C6-pCMV与C6组细胞倍增时间差别不大，差异无统计学意义(P>0.05)，提示Cx43蛋白过表达后C6细胞增殖速度明显减弱。

Fig 1 Relative Cx43 protein level of each group

**P<0.01vsC6

Fig 2 The cell growth curve of each group

**P<0.01vsC6

2.3 软琼脂集落培养实验测定各组细胞恶性增殖程度 实验以肉眼可见的细胞团(含500个以上细胞)作为计数集落的标准。C6组、C6-pCMV组在含0.003的软琼脂培养基中生长良好，每个孔中可见有多个集落形成，集落数分别为(33±4)、(36±4)，而C6-Cx43组集落数为(7±2)。如Fig 3所示，C6-Cx43组与C6组相比，软琼脂中的集落数明显减少(P<0.01)；而C6-pCMV组与C6组相比集落数相当，差异无统计学意义(P>0.05)。提示过表达Cx43后C6细胞的恶性增殖程度降低。

Fig 3 The cell colony number of each group

**P<0.01vsC6

2.4 ERK1/2阻断剂PD98059处理后Cx43、p-Cx43、p-ERK1/2的表达情况 各组细胞用ERK1/2阻断剂PD98059(30 μmol·L-1)处理2 h后收集细胞，提取总蛋白，检测各组细胞Cx43、p-Cx43、p-ERK1/2的表达情况。如Fig 4A所示，C6-Cx43 +PD98059组较C6-Cx43组Cx43蛋白表达增多(P<0.05)，提示ERK1/2途径被阻断后，Cx43蛋白表达明显上调；C6-Cx43+PD98059组较C6-Cx43 组p-Cx43蛋白表达减少(P<0.05)，提示ERK1/2途径受阻断后，p-Cx43蛋白表达明显下调。如Fig 4B所示，C6-Cx43 +PD98059组较C6+PD98059组p-ERK1/2蛋白表达量明显下调(P<0.05)，提示Cx43蛋白高表达降低了p-ERK1/2蛋白表达水平。

2.5 p38MAPK阻断剂SB202190处理后Cx43、p-Cx43、p-p38MAPK的表达情况 各组细胞用p38MAPK阻断剂SB202190(30 μmol·L-1)处理2 h后收集细胞，提取总蛋白，检测各组细胞Cx43、p-Cx43、p-p38MAPK的表达情况。如Fig 5A所示，C6-Cx43 +SB202190组较C6-Cx43组Cx43蛋白表达增多(P<0.05)，提示p38MAPK途径被阻断后，Cx43蛋白表达明显上调；C6-Cx43 +SB202190组较C6-Cx43组p-Cx43蛋白表达减少(P<0.05)，提示p38MAPK途径受阻断后，p-Cx43蛋白表达明显下调。如Fig 5B所示，C6-Cx43 +SB202190组比C6+SB202190组p-p38MAPK蛋白表达量明显下调(P<0.05)，提示Cx43蛋白高表达明显降低了p-p38MAPK蛋白表达水平。

2.6 ERK1/2、p38MAPK阻断剂处理后MTT比色法测定细胞活性 如Fig 6、7所示，C6-Cx43组较C6组吸光度值明显减少(P<0.01)，提示Cx43蛋白过表达后C6细胞增殖能力明显下降；C6+PD98059组、C6+SB202190组较C6组吸光度值均明显减小(P<0.01)，C6-Cx43+PD98059组、C6-Cx43+SB202190组较C6-Cx43组吸光度值均明显减小(P<0.05)，提示经ERK1/2、p38MAPK阻断剂处理后C6细胞增殖能力明显下降。

Fig 4 Relative Cx43, p-Cx43(A) and p-ERK1/2(B)protein levels of each group

1:C6;2:C6-pCMV;3:C6-Cx43;4:C6+PD98059;5:C6-pCMV+PD98059;6:C6-Cx43+PD98059.**P<0.01vsC6;#P<0.05vsC6-Cx43

Fig 5 Relative Cx43, p-Cx43(A) and p-p38MAPK(B)protein level of each group

1:C6;2:C6-pCMV;3:C6-Cx43;4:C6+SB202190;5:C6-pCMV+SB202190;6:C6-Cx43+SB202190.**P<0.01vsC6;#P<0.05vsC6-Cx43

Fig 6 The absorbance values of each group

1:C6;2:C6-pCMV;3:C6-Cx43;4:C6+PD98059;5:C6-pCMV+PD98059;6:C6-Cx43+PD98059.**P<0.01vsC6;#P<0.05vsC6-Cx43

Fig 7 The absorbance values of each group

1:C6;2:C6-pCMV;3:C6-Cx43;4:C6+SB202190;5:C6-pCMV+SB202190;6:C6-Cx43+SB202190.**P<0.01vsC6;#P<0.05vsC6-Cx43

3 讨论

GJIC与肿瘤密切相关，多数肿瘤细胞中发现Cxs突变、表达或胞内定位改变，GJIC能力降低或丧失[6]。Cx43作为构成GJIC的重要组成部分，在很大程度上调控着GJIC的功能。有研究者指出，脑胶质瘤恶性程度越高，GJIC功能越弱，Cx43表达越少[7]。将Cx43转染于人脑胶质瘤细胞U251和T98G，细胞增殖明显受到抑制，由此推测，Cx43可能是一种抑癌基因[8]。之后有许多研究都表明，Cxs能够抑制肿瘤细胞增殖，并把它视为一个抑癌基因家族，且Cxs可通过多种途径抑制肿瘤的增殖。MAPK信号通路对Cx43的调节近年来已成为一研究热点，其中ERK1/2、p38MAPK这两条通路已被证实可以调节Cx43的表达。ERK1/2和其他的一些激酶能促使缝隙连接蛋白Cxs磷酸化，从而调控缝隙连接通道的开合，同时它还能诱导Cx43的内吞作用。致癌物质通过激活细胞中ERK1/2通道，使细胞在早期核小体中滞留Cx43使得肿瘤细胞中Cx43蛋白的表达量减少，进而导致GJIC功能下降[9]，该研究结果提示，化学物质激活MAPK信号转导通路并使得抑癌基因Cx43的功能受到抑制，导致细胞生长失控，肿瘤细胞增殖[10]。p38MAPK同样为MAPK家族中的重要成员，是调节细胞内生理和病理功能的主要信号通道，通过由Cx43蛋白组成的GJ，与胞内其他信号物质协同调节ATP的释放[11]。肿瘤细胞间缝隙连接通讯的减少和细胞膜通透性的增加也受到p38MAPK活性的调节[12]。有实验证明，Cx43的磷酸化导致GJIC功能减弱，p38MAPK的激活也会导致GJIC的减少。Cx43的磷酸化激活可能导致Cx43蛋白的损耗，而这些损失可能就是细胞间缝隙连接减少和GJIC减少的原因[13]。Cx43的高度磷酸化和Cx43表达的减少导致细胞间通讯的减少，Cx43的高度磷酸化部分原因是受到p38MAPK下游的两个直接靶点Ser279和Ser282位点的调节，相反，p38MAPK活性的抑制使Cx43的磷酸化减少[14]。同时p38MAPK的活性的抑制也能导致缝隙连接蛋白ATP释放通道的开放和诱导巨噬细胞死亡。在肿瘤细胞中p38MAPK介导肿瘤细胞有选择性的迁移，而这种效应是通过Cx43来调节的[15]。 本实验从基因水平上调Cx43表达，观察大鼠脑胶质瘤细胞C6增殖能力的变化。应用脂质体将Cx43重组质粒转染于C6细胞并用G418筛选，得到C6-Cx43稳定转染细胞株，同时以转染空质粒组为阴性对照组。通过体外培养测定细胞倍增时间发现C6-Cx43组细胞增殖速度明显降低，软琼脂集落培养实验发现C6-Cx43组细胞恶性增殖程度减弱；ERK1/2、p38MAPK阻断剂处理后Western blot检测发现C6细胞Cx43表达升高，p-Cx43表达降低；MTT法检测细胞活性发现，ERK1/2、p38MAPK阻断剂处理后C6细胞增殖能力减弱。综上所述，本实验提示Cx43蛋白可能通过ERK1/2、p38MAPK通路抑制脑胶质瘤C6细胞的增殖。

Cx43抑制肿瘤细胞增殖，可能存在多种机制相互作用。我们研究的MAPK信号通路，从信号转导的角度证明了Cx43可以对细胞的增殖产生影响，是Cx43作为抑癌因子抑制肿瘤细胞增殖的机制之一，为临床研究抗肿瘤药物提供新的途径和靶点，为Cx43的临床应用奠定坚实的理论基础。

[1] 彭力超,梁尚栋.缝隙连接与神经病理性痛的研究进展[J].中国药理学通报,2015,31(2):157-62.

[1] Peng L C,Liang S D.Recent research progress on the role of gap junction in neuropathic pain[J].ChinPharmacolBull,2015,31(2):157-62.

[2] Herrero-gonzález S,Gangoso E,Giaume C,et al.Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells[J].Oncogene,2010,29(42):5712-23.

[3] 洪 涛,何安慰,卢明巍,等.转染Cx43cDNA对胶质瘤细胞生长影响的观察[J].中国神经肿瘤杂志,2006,4(2):134-8.

[3] Hong T,He A W,Lu M W,et al.Effect of Cx43 cDNA transfection on the growth of glioma cells[J].ChinJNeurOncol,2006,4(2):134-8.

[4] McLachlan E,Plante I,Shao Q,et al.ODDD-linked Cx43 mutants reduce endogenous Cx43 expression and function in osteoblasts and inhibit late stage differentiation[J].JBoneMinerRes,2008,23(6):928-38.

[5] Son Y,Cheong Y K. Mitogen-activated protein kinases and reactive oxygen species: how can ROS activate MAPK pathways?[J].JSignalTransduct,2011,2011:792639.

[6] Liu L,Gao Z,Zhang L,et al.Temporal dynamic changes of connexin 43 expression in C6 cells following lipopolysaccharide stimulation[J].NeuralRegenRes,2012,7(25):1947-53.

[7] Moinfar Z,Dambach H,Schoenebeck B,et al.Estradiol receptors regulate differential connexin 43 expression in F98 and C6 glioma cell lines[J].PLoSOne,2016,11(2):e0150007.

[8] Huang R P,Fan Y,Hossain M Z,et al. Reversion of the neoplastic phenotype of human glioblastoma cells by connexin 43(cx43)[J].CancerRes,1998,58(22):5089-96.

[9] Hernandez M,Shao Q,Yang X J,et al.A histone deacetylation-dependent mechanism for transcriptional repression of the gap junction gene cx43 in prostate cancer cells[J].Prostate,2006,66(11):1151-61.

[10]Park J H,Lee M Y,Heo J S,et al.A potential role of connexin 43 in epidermal growth factor-induced proliferation of mouse embryonic stem cells: Involvement of Ca2+/PKC, p44/42 and p38 MAPKs pathways[J].CellProlif,2008,41(5):786-802.

[11]Tacheau C,Fontaine J,Loy J,et al.TGF-beta induces connexin43 gene expression in normal murine mammary gland epithelial cells via activation of p38 and PI3K/AKT signaling pathways[J].JCellPhysiol,2008,217(3):759-68.

[12]Yang S R,Cho S D,Ahn N S,et al.Role of gap junctional intercellular communication(GJIC) through p38 and ERK1/2 pathway in the differentiation of rat neuronal stem cells[J].JVetMedSci,2005,67(3):291-4.

[13]Behrens J,Kameritsch P,Wallner S,et al.The carboxyl tail of Cx43 augments p38 mediated cell migration in a gap junction-independent manner[J].EurJCellBiol,2010,89(11):828-38.

[14]Aravindakshan J,Cyr D G.Nonylphenol alters connexin 43 levels and connexin 43 phosphorylation via an inhibition of the p38-mitogen-activated protein kinase pathway[J].BiolReprod,2005,72(5):1232-40.

[15]Zvalova D,Cordier J,Mesnil M,et al. p38/SAPK2 controls gap junction closure in astrocytes[J].Glia,2004,46(3):323-33.

Effect of Cx43 on proliferation of C6 glioma cells and its mechanisms

LI Ye-ru, PANG Xiang-mei, LI Min, WANG Qing, YANG Yu-qing, HAN Xiao-jian, JIANG Li-ping
(SchoolofPharmaceuticalScience,NanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Aim To explore the effect of Cx43 over-expression on proliferation of C6 cells and its mechanisms by transfecting pCMV-Cx43cDNA plasmid into C6 cells.Methods pCMV-Cx43cDNA plasmid was transfected into C6 cells by liposome to up-regulate the expression of Cx43, and C6 cells with over-expression of Cx43 was stably cloned by using G418. Determination of cell doubling time and soft agar colony formation assay to detect the degree of cell proliferation.The cells were treated with ERK1/2 specific blocker PD98059(30 μmol·L-1) and p38MAPK specific blocker SB202190(10 μmol·L-1)respectively, the expression of Cx43, p-Cx43, p-ERK1/2 and p-p38MAPK of each group were detected by Western blot, and the activity of each group was detected by MTT Assay. Results pCMV-Cx43cDNA plasmid was transfected into C6 cells successfully. Cell lines with over-expression Cx43(C6-Cx43) or empty vector (C6-pCMV) were stably selected by using G418. Determination of cell doubling time and soft agar colony formation experiments showed that the proliferative rate and the colony number of C6-Cx43 group were significantly decreased, compared with that of C6 group and C6-pCMV group(P<0.01); ERK1/2, p38MAPK specific blockers were treated with each group,Western blot showed that the expression of Cx43 protein was increased(P<0.01), while p-Cx43 protein was decreased (P<0.05) in C6-Cx43+PD98059 group and C6-Cx43+SB202190 group，compared with that of C6-Cx43 group. Conclusion Cx43 may decrease the proliferation of glioma cells through ERK1/2, p38MAPK pathways.

glioma cells C6; Gap Junction;Cx43;proliferation;ERK1/2; p38MAPK

2017-04-11,

2017-05-20

国家自然科学基金资助项目(No 81660014，30760286)；江西省自然科学基金资助项目(No 20142BAB205022)

李业如(1994-)，女，硕士生，研究方向：心血管药理学，E-mail: liyeru0564@163.com; 蒋丽萍(1965-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：心血管药理学，通讯作者，Tel:0791-86301368,E-mail: lipingjiang2002@aliyun.com; 韩小建(1974-)，男，博士，硕士生导师，研究方向：线粒体动态变化，通讯作者，Tel:0791-86318955,E-mail: hanxiaojian@hotmail.com

时间：2017-6-7 19:04 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.048.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.024

A

1001-1978(2017)07-1008-06

R-332；R329.24；R730.264；R739.41；R977.6