交叉对话信号的分子绝缘——对创新药物设计的思考

陶 丽，金 凤，王海波，钱亚云，孙 云，陆 茵，刘延庆

(1. 扬州大学医学院，江苏 扬州 225001；2. 国家中医药管理局胃癌毒邪论治重点研究室，江苏 扬州 225001；3. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；4. 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023)

交叉对话信号的分子绝缘
——对创新药物设计的思考

陶 丽1, 2，金 凤1, 2，王海波1, 2，钱亚云1, 2，孙 云1，陆 茵3, 4，刘延庆1, 2

(1. 扬州大学医学院，江苏 扬州 225001；2. 国家中医药管理局胃癌毒邪论治重点研究室，江苏 扬州 225001；3. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；4. 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023)

生物信号通路的交叉对话(cross-talk)是指众多信号通路共享同一关键组分，形成一种蝴蝶领结(bow-tie)样的网络拓扑结构。交叉对话对终末基因的调节表现出功能冗余、协同及拮抗，同时又要避免通路之间互相串扰带来的信号噪音或信号溢出，进化出一套维持细胞对不同外界应激产生特异性应答的绝缘(insulation)机制，对维持细胞内稳态有着非常重要的生物学意义。交叉对话及其分子绝缘机制提示：对话分子对细胞命运调控的两重性，要求实现靶向对治疗有利的对话分子而避开对治疗不利的对话分子；对话分子以大分子复合物为功能载体，在信号绝缘中对话分子互作界面构象的高度可塑性，设计开展药物结合与药理活性关联性研究。因此，以信号通路的交叉对话及其分子绝缘机制指导创新药物设计，对解决当前药物研发的瓶颈和临床困境具有重大的指导意义。

信号转导；交叉对话；信号绝缘；成靶性；药物接近；蛋白动态；药物设计

系统生物学从生物调控网络的角度描述复杂的生命过程，有助于在宏观上理解疾病的发生发展机制，并指导设计有效的干预策略。生物调控网络表现出典型的拓扑学结构特性，无论是基因调控网络、信号转导网络、蛋白质相互作用网络还是代谢网络，广泛存在多条输入信号汇集于小部分中间信号(waist)再发散出多条输出信号的蝴蝶领结(bow-tie)或沙漏(hourglass)状的结构模块。在真实的细胞世界中，通过有限信号通路之间的交叉对话(cross-talk)使细胞能够灵活调整状态，适应它所处的环境变化。交叉对话对靶基因调节是多样的，包括共能冗余(补偿)、协同和拮抗，是细胞生物学行为调控的普遍模式。同时，信号通路的交叉对话是受到严格调控的，错误的交叉对话会引起通路间的串扰使细胞失去对不同外界环境作出不同应答的能力，这对维持细胞内稳态具有重要的生物学意义。因此，生物系统在整合多条信号通路调节不同生物学过程的同时进化出一种维持细胞内通讯特异性的机制，即信号绝缘(insulation)机制[1]。对信号绝缘分子机制的深入研究，不仅为阐明具体的信号转导调控行为，更为信号转导机制缺陷的疾病开发有效的干预措施提供了全新的视角。

1 交叉对话通讯绝缘的分子机制

所谓信号绝缘，是指不同种类信号通路在受同一单元的调节过程中保持绝缘体的特性，即不同的上游信号经过同一信号传递分子后又能保持各自独立的特异的信号应答过程。信号通路的交叉对话一般是指对话分子在物理上通过与不同信号通路特异的蛋白相互作用而参与各种信号应答，具有高度组织化的结构模块特征(modularity)，并受到时间和空间动力学的精细调控，从而保障每一种信号输入能够忠实地沿着各自的信号轴传递并产生相应的信号输出[2]。

1.1 配体介导的信号正负反馈机制使对话分子下游信号发生重定向(redirection) 其作用模式如Fig 1A。生物学功能的调节包括非自动控制、前馈控制以及反馈控制。反馈中的正反馈可以使信号放大而负反馈可以使信号缩减，从而控制信号传递的程度并改变信号传递的性质。Santos等[3]通过对丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)各信号组分实施功能干扰发现，表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)通过负反馈抑制鸟苷释放蛋白导致胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinases 1/2, ERK1/2)只能短暂活化，而神经生长因子(nerve growth factor, NGF)通过ERK1/2向Raf信号转导正反馈导致ERK1/2持续活化，分别引起大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞增殖和分化这两种截然不同的细胞命运。这证明了信号对话的共享关键组分具备双稳定性(bistability)，通过前后反馈控制产生的不同活化信号维度(信号振幅、频率、时间、方向)，使之调控不同的生物学过程。

1.2 脚手架蛋白提供给对话分子磷酸化级联组件的停泊位点而产生专一性应答 其作用模式如Fig 1B。酵母对高渗应激、交配信息素等外界信息刺激的信号应答都依赖于MAPK信号级联，只有对不同刺激的应答保持高度的专一性，才能保证酵母细胞对不同的外界环境信息作出合适的应答。之前认为这种专一性是依赖于对话下游级联的彼此沉默，而Patterson等[4]利用融合表达荧光蛋白活性示踪的方法对山梨醇高渗应激引起的Hog1/MAPK和α-因子信息素诱导的Fus3/MAPK信号级联进行研究并否认了这一观点。这两种MAPK信号级联的4种相同组件(Ste11、Ste20、Ste50、Cdc42)是通过其中的Ste11分别被招募至Pbs2和Ste5这两种不同的脚手架蛋白上而被绑定的，是不同MAPK信号互相绝缘的重要分子基础。在Hog1缺陷的酵母里，高渗应激也能活化信息素介导的MAPK级联从而产生通讯串扰，没有了Hog1对Ste11磷酸化作用及Pbs2的绑定作用，Ste11逃逸至Ste5产生交配信息素的应答。因此Hog1介导的Ste11磷酸化对这4种共有的磷酸化级联组分正确组装至Pbs2上从而发挥高渗应激专一性应答十分关键。而晶体结构解析和分子模拟的方法进一步证实脚手架蛋白Ste5的构象变化是引起信息素介导的Fus3/MAPK信号正确选择的内在机制[5]。

1.3 对话分子多样的磷酸化位点或异源亚基的多样性组装而产生专一性应答 其作用模式如Fig 1C。底物磷酸化和去磷酸化调节是细胞内外信号传递的主要方式。对同一底物氨基酸残基磷酸化修饰位点不同，其蛋白的活性和定位也不同。例如肌细胞相关转录因子的丝氨酸Ser 33与Ser 98磷酸化对其核定位具有相反作用，前者促进其核输入而后者促进其核输出[6]。这可能是一种广泛现象，许多激酶调节结构域对激酶结构域的构象选择从而产生了激酶自磷酸化对激酶活性的调控。而蛋白磷酸酶，其种类要比激酶少10个数量级，对去磷酸化底物更具泛杂性(promiscuity)，但在实际执行一对多的任务时仍可以实现区别对待。例如，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(protein phosphatase 2, PP2A)是催化亚基C、结构亚基A(2种亚型)和调节亚基B(2种亚型)组成的三聚体全酶，其底物特异性的分子基础是其高度可变的调节亚基(23种亚型)，这3种亚基可组装形成近百种不同识别不同底物的异源三聚体，实现了对每种底物专一性和信号通讯的特异性[7]。

1.4 对话分子的空间性调节使其在不同的信号微区(microdomian)内实现信号通讯 其作用模式如Fig 1D。物理性的信号区室化(compartmentalization)使不同信号区室内的对话分子各司其职是信号绝缘的主要机制。例如，富含胆固醇和鞘磷脂的脂筏微区与非脂筏微区内的Akt信号通讯。Gao等[8]利用荧光能量共振转移技术发现胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)介导总Akt的活化依赖于脂筏微区，将脂筏微区破坏以后既影响了脂筏微区内Akt活性也影响了非脂筏微区内的Akt活性，而血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)介导的总Akt活化是不依赖于脂筏微区，将脂筏微区破坏以后仅削弱了脂筏微区内Akt活性，但不影响非脂筏微区内Akt活性。除了胞质膜上的脂筏微区，细胞内还存在像多泡内含体(multivesicular endosomes)结构的游离脂筏微区。例如，糖原合成激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)，一种细胞内广泛分布并参与多条信号通路的蛋白激酶，在Wnt信号通路活化过程中，GSK-3被多泡内含体的脂质结构隔离起来从而解除了其对β-cantenin的抑制作用[9]。

1.5 对话分子的时间性调节产生使其在不同的信号通讯间切换(switch) 其作用模式如Fig 1E。脚手架蛋白还具有信号开关功能。EGF激活受体酪氨酸激酶需结合含有丰富磷酸化酪氨酸结合域(pTyr-binding domain, PTB)的脚手架蛋白Shc1启动下游磷酸化级联事件。Zheng等[10]利用定量蛋白质组学技术发现在EGF信号的早期阶段，Shc1迅速将Grb2适配体蛋白、酪氨酸蛋白磷酸酶Ptpn12等连续招募至自身的PTB上，启动Ras/ERK/MAPK与Akt信号通路，介导细胞的增殖、存活等生物学过程；而在EGF信号的晚期阶段，激活的Akt信号反馈性磷酸化Shc1，导致Grb2被另一适配体蛋白SgK269置换，使前者的信号终止，转而介导细胞侵袭、骨架重排等生物学过程。因此随着EGF信号时间的推移，Shc1通过构象变化招募具有截然不同功能的适配体蛋白，使EGF受体的信号输出以交叉抑制(cross-inhibition)的方式实现切换。

Fig 1 Five proposed models of signal insulation mechanisms

A: The feedback and feedforward control by cross-talk molecule leading to signal specificity; B: Interactions of cross-talk molecule with various scaffold proteins leading to signal specificity; C: Multiple phosphorylation sites in cross-talk molecule leading to signal specificity; D: Cross-talk molecule in compartmentalized microdomains leading to signal specificity; E: Temporal regulation of cross-talk molecule by scaffold protein leading to signal specificity.

2 交叉对话信号绝缘机制对药物研发模式的思考

对话分子通常是信号通路中起主导地位关键作用的分子(hubs)，如蛋白激酶，并设计小分子激酶抑制剂进行干预。然而多数临床肿瘤患者却因缺乏足够的响应而治疗失败，肿瘤细胞或许通过衍生新的交叉对话而获得耐药。对话绝缘机制指出了当前药物研发模式的缺陷，并极大地丰富了药靶调节和新药研发的认知。

2.1 对话分子对细胞命运调控具有两重性故而限制了药物对靶点的成靶性(targetability) 对话分子功能的多效性使其能否成为药物靶点存在争议，引起所谓的治疗性副作用(on-target side effects)。例如在肿瘤的演进中，许多对话分子都被揭示为披着羊皮的狼或是披着狼皮的羊，与某条信号通路交叉对话时扮演肿瘤促进因子的角色，而与另一条信号通路交叉对话时又扮演肿瘤抑制因子的角色。因此，应该靶向对治疗有利的对话分子而避开对治疗不利的对话分子，择性干预或纠正执行某一任务、某一特定比例的有问题对话分子而不是所有的对话分子。信号绝缘机制提示我们，利用对话分子的上游受不同信号通路分子调控的特点，可以产生对某一信号途径的选择性应答。例如，GSK-3在胰岛素介导的Akt/GSK-3以及Wnt配体介导的低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low density lipoprotein receptor-related protein 6, LRP-6)/GSK-3这两条信号途径中是互相绝缘的。Akt通过磷酸化GSK-3的Ser 9/21位点使其N端成为自身假底物而封闭了激酶活性，而LRP-6则通过PPPSxP模序直接抑制GSK-3的激酶活性。在胰岛素介导的Akt/GSK-3信号途径中，GSK-3活性被抑制后则激活其底物糖原合成酶(glycogen synthase, GS)的活性，从而促进了糖原的合成代谢，使血糖水平降低；在经典Wnt信号途径中，GSK-3活性被抑制后则稳定了其底物β-catenin蛋白而增加了肿瘤发生的风险。因此在糖尿病的治疗中，需要抑制GSK-3活性以促进胰岛素敏感性，但又不能同时引起Wnt信号通路的活化。为此，有人设计了一种嵌合多肽LRP-GSK-3，该多肽包含LRP-6上抑制GSK-3活性的氨基酸模序(PPPSPxS)、GSK-3的N端上受Akt磷酸化抑制作用的氨基酸模序(RxRxxS)以及促进该多肽跨细胞膜运输的氨基酸模序，该嵌合多肽的特点是竞争Akt对内源性GSK-3磷酸化作用后使其对糖原合成酶的磷酸化作用受到抑制，又由于LRP模序的存在，使其在响应Akt介导的GSK-3失活同时又不会激活Wnt信号通路[11]。因此，设计嵌合肽药物，是一种以对话分子自身的调节机制为切入点并加以利用的药物研发策略(Fig 2A)。

2.2 酶-底物-脚手架蛋白复合物不同于纯酶环境故而限制了药物对靶点的可接近性(accessibility) 传统上，人们通过对酶的克隆表达纯化，在纯酶的水平开展小分子抑制剂的筛选。信号绝缘机制提示我们，对话分子是基于大分子复合物的分子平台上发挥功能的，该平台由多达几十个甚至上百个亚单位构成，结合态分子不能等同于体外非结合态分子所处的反应环境，例如磷酸化级联反应引起复合物内的电荷环境就是在体外纯酶水平无法模拟的。这就要求以蛋白质复合物而不是单一受体的晶体结构开展分子模拟及高通量虚拟筛选，药物结合比药物结构影响药理效应的关系中更为关键。在酶-底物-脚手架蛋白复合物中，脚手架蛋白的存在不影响锚定酶与底物及其催化活性，但影响了药物作用位点的暴露程度。一旦药物作用位点被封闭，药物就很难接近，如同基因编辑中染色质可接近性(chromatin accessibility)决定性地影响CRISPR-Cas9对靶基因切割on-target效率一样。Greenwald等[12]发现蛋白激酶(protein kinase C, PKC)绑定于A激酶锚定家族的脚手架蛋白AKAP7α时，就会降低ATP竞争性抑制剂Gö6976以及底物竞争性抑制剂PKC 20-28对酶抑制的敏感性。Stes等[13]对靶标进行有限水解从而对释放片段进行质谱解析的方法开展BRAF抑制剂研究，该方法在不影响脚手架蛋白的信号切换功能的情况下对激酶活性产生强烈抑制。因此，大分子复合物构象的可塑性要求在单个氨基酸的水平对蛋白质互作界面开展药物设计与功能筛选，包括互作界面的热点(hot-spots)分析[14]，加强药物结合、药理活性以及脱靶效应的关联性研究(Fig 2B)。

Fig 2 Two concepts for rational drug design inspired by signal insulation mechanisms

A: Chimeric peptide mediates selective inhibition of signal cross-talk; B: Small-molecule approach competing with the binding of the “hot spots” in the interaction surface between the cross-talk molecule and scaffold protein during conformational transitions mediates selective inhibition of signal cross-talk

3 结语与展望

以交叉对话信号通路的绝缘现象指导药物设计极具前瞻性，Behar等[15]创新性地提出将信号转导网络结点的拓扑学特征及其动力学调控定义为药理学靶标，利用不同配体激活NF-κB信号通路的信号输出时间尺度不同，采用数学建模、计算生物学的方法筛出能药理学上抑制不同配体激活NF-κB信号通路的化合物。但是，信号通路的交叉对话不是随机的，面对瞬息万变的外界环境，生物系统到底启用并选择何种相对简单可靠且容易进化的方式实现高效的分子绝缘以及信号通路的切换？因此，阐明对话分子功能演进和信号绝缘机制才是指导能够实现真正靶向意义创新药物发现的关键。目前，国际医药巨头革命性地利用先进的分子成像与结构生物学技术开展以蛋白动态(protein dyamics)或蛋白影像，而非静止蛋白构象为靶标的药物设计，以期寻找到合适的药物作用位点和药物结构。以上基于细胞内蛋白真实调控过程和分子事件驱动(event-driven)的药物设计，有助于理解蛋白构象变化介导的信号绝缘机制，并推动以对话分子为靶点的药物研究。

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Insulation of cross-talk between signaling pathways-inspiration for innovative drug design

TAO Li1, 2, JIN Feng1, 2, WANG Hai-bo1, 2, QIAN Ya-yun1, 2, SUN Yun1, LU Yin3, 4, LIU Yan-qing1, 2
(1.CollegeofMedicine,YangzhouUniversity,YangzhouJiangsu225001,China; 2.TheStateAdministrationofTraditionalChineseMedicineKeyLabofToxicPathogens-BasedTherapeuticApproachesofGastricCancer,YangzhouJiangsu225001,China; 3.Collegeofpharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 4.JiangsuKeyLabforPharmacologyandSafetyEvaluationofChineseMateriaMedica,Nanjing210023,China)

Cross-talk of intracellular signaling pathways that share common components (hubs) is organized in form of a bow-tie network topology. Signaling cross-talk is functionally pleiotropic for target genes regulation, resulting in functional redundancy, synergism and antagonism, which should be precisely controlled to prevent signaling ‘leaking’ or ‘spillover’. Thus, the biological system has evolved multiple insulating mechanisms to achieve stimulus-specific response that maintains intracellular homeostasis. The insulation mechanism of signaling cross-talk suggests: (1) the functional duality of cross-talk molecules that determine cell fate requires selectively targeting dysregulated cross-talk molecules while protecting the normal ones from off-target or unintended effects, and we propose them as the targetable cross-talk molecules; (2) cross-talk molecules are usually carried on the macromolecular complex as their functional platforms, thus the structural plasticity of conformational changes at the interaction surface of cross-talk molecules asks for intensive work on the relationship study between drug binding and biological activity, which we propose as the accessible cross-talk molecules. Therefore, signaling cross-talk and its insulation mechanism play instructive leading roles in resolving the bottlenecks of current drug R&D and improve the clinical outcome.

signaling transduction; signaling cross-talk; signaling insulation; targetability; drug accessibility; protein dynamics; drug design

2017-04-18,

2017-05-20

国家自然科学基金资助项目(No 81573656);中国博士后科学基金(No 2017M611396)

陶 丽(1986-)，女，博士，讲师， 研究方向：中药抗肿瘤药理学，E-mail：imlitao@yzu.edu.cn； 刘延庆(1956-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：中西医结合肿瘤治疗学，通讯作者，E-mail: liuyq@yzu.edu.cn

时间：2017-6-7 19:04 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.008.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.004

A

1001-1978(2017)07-0900-05

R319；R329.2；R35；R916.1