高效液相色谱法检测运动饮料中的L-肉碱

周文清

（景德镇陶瓷大学，江西景德镇333000）

高效液相色谱法检测运动饮料中的L-肉碱

周文清

（景德镇陶瓷大学，江西景德镇333000）

建立一种快速、有效的高效液相色谱法测定运动饮料中L-肉碱的方法。样品经1.0 mmol/L盐酸提取后，采用MCX固相萃取小柱进行净化和富集。采用RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离，以乙腈∶辛烷磺酸钠（50 mmol/L）=25∶75（体积比）作为流动相，用PDA检测器检测，外标法峰面积定量。结果表明，L-肉碱标液在1.0 μg/mL～20.0 μg/mL浓度范围内线性良好，相关系数r2为0.999，检出限为0.1 mg/kg，定量限为0.3 mg/kg，加标回收率达到82.3%～84.1%。

高效液相色谱；运动饮料；L-肉碱

肉碱的化学结构中有左旋（L-）和右旋（O-）两种旋光异构体，而自然界中只存在L-肉碱，且只有L-肉碱有营养功效。研究表明L-肉碱可以有效防止运动后血液中乳酸浓度升高，提高人体的耐受力和抵抗力[1-3]。目前许多国家的运动员用L-肉碱作为提高体能的营养补充剂，体育运动后人体肌肉组织中的游离肉碱浓度下降20%左右，可以通过补充外源L-肉碱得到改善，从而促进体内脂肪氧化产能，提高运动成绩。所以添加了L-肉碱为生理活性成分的运动饮料，也开始成为运动饮料的一个卖点，开始悄然流行起来。但是目前还没有针对运动饮料中L-肉碱的检查方法，所以本试验针对运动饮料中L-肉碱开发一种快速有效的检测方法。

目前，针对L-肉碱的检测方法主要有酶法测定法、毛细管电泳色谱法、高效液相色谱法等[4-10]。酶法测定法的原理是加入的DTNB试剂能与L-肉碱中的化学键发生反应，生成4-硝基苯酚化合物，它在412 mn处有强烈的吸收峰，可以据此来定量L-肉碱的含量，但是此法易收到其溶液内的硫醇物质干扰，影响结果的准确性。高效液相色谱法为现在常用的检出方法，但是在前处理的步骤上繁琐，费时，试验成本较大。本试验在原有的高效液相色谱法的基础上，对前处理步骤进行改进，改用固相萃取法对L-肉碱进行样品的富集和净化，并对检测条件进行优化，使得对运动饮料中L-肉碱的检测能够做到快速、准确的目的，适用于日常快捷的检测。肉碱的结构图见图1。

图1 肉碱的结构图Fig.1 Structure of carnitine

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

2695型号高效液相色谱系统，配2998型号PDA检测器：Waters；L-肉碱标准品：国家标准物质中心；甲醇、乙腈为色谱纯；MCX、WCX、HLB固相萃取小柱：规格 3 cc，250 mg。

1.2 样品来源

样品为市场上销售的标称含有L-肉碱的运动饮料。

1.3 色谱条件

色谱柱：RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

柱温：30℃。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件的优化

固定流动相流速1.0 mL/min，配制不同体系的流动相体系，甲醇/磷酸二氢钾体系、甲醇/辛烷磺酸钠体系、乙腈/磷酸二氢钾体系和乙腈/辛烷磺酸钠体系，考察4种流动相对L-肉碱色谱行为的影响；并优化合适的流动相pH值，使得目标峰的出峰时间合适，峰形尖锐、对称。

1.4.2 检测波长的选择

本试验采用PDA检测器进行全波长扫描（扫描范围190 nm～400 nm），根据L-肉碱标准品的响应值，选择比较合适的检测波长。

1.4.3 标准曲线的制作

称取相应质量的L-肉碱标准品，配制成浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、20.0 μg/mL 的标准溶液，进行仪器分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.4.4 样品前处理条件的优化

根据L-肉碱有较好的水溶性和醇溶性的特点，本试验比较甲醇、乙醇、1.0 mmol/L盐酸溶液等3种提取溶液对L-肉碱的提取效果。

选择较优的提取溶液后，比较常用的WCX固相萃取柱、HLB固相萃取柱以及MCX固相萃取柱等3种固相萃取柱对样品富集净化的效果。

1.4.5 加标回收试验及样品测定

以市售未添加L-肉碱的运动饮料为空白基质，加入标准溶液，选择优化后的前处理条件操作，过MCX固相萃取柱，上机检测，计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

参考相关标准和文献，发现不同标准文献检测L-肉碱的流动相体系不同，主要分为四大类流动相体系：甲醇/磷酸二氢钾体系、甲醇/辛烷磺酸钠体系、乙腈/磷酸二氢钾体系和乙腈/辛烷磺酸钠体系。为了了解这些流动相对L-肉碱色谱行为的影响，固定流动相洗脱速度，配制不同体系的流动相Ⅰ：甲醇-磷酸二氢钾缓冲（50 mmol/L）（体积比为25∶75）；流动相Ⅱ：甲醇-辛烷磺酸钠（50 mmol/L，pH）（体积比为 25∶75）；流动相Ⅲ：乙腈-磷酸二氢钾缓冲（50 mmol/L）（体积比为25 ∶75），流动相Ⅳ：乙腈-辛烷磺酸钠（50 mmol/L，pH）（体积比为25∶75），考察流动相对L-肉碱色谱行为的影响。

在确定好流动相体系后，要进一步优化流动相体系的pH值，使目标峰的出峰峰形尖锐、对称。考虑到L-肉碱是两性化合物，在酸性流动相溶液中，羧基电离被抑制，而季铵基团带正电荷，与流动相中的辛烷磺酸根阴离子形成离子对，会在C18柱上有保留。本试验以磷酸来调节流动相的pH值，考察pH值与目标峰保留时间的关系。L-肉碱的色谱图见图2。

结果表明：甲醇、乙腈在分离和保留L-肉碱上并没有明显差别，考虑到乙腈洗脱能力更强，选用乙腈做为流动相体系之一。乙腈/磷酸二氢钾体系与乙腈/辛烷磺酸钠体系相比，乙腈/辛烷磺酸钠体系能更好的将样品中的杂质峰分开。

当乙腈/辛烷磺酸钠流动相pH值在2.5到3.5范围内，降低流动相的pH值，峰形改善并延长保留时间，当pH值大于3.3时，色谱峰呈较为明显的前延峰。综合考虑分离度、柱子耐受性、保留时间等因素，选择流动相体系pH3.0时，目标峰在色谱柱上能得到良好的基线分离，其峰型良好，出峰时间合适。

2.2 检测波长的选择

本试验采用PDA检测器对L-肉碱进行全波长扫描（范围190 nm～400 nm）。L-肉碱的全波长扫描图见图3。

图2 L-肉碱色谱图Fig.2 The chromatograms of L-carnitine

图3 L-肉碱的全波长扫描图Fig.3 Full wavelength scanning chart of L-carnitine

如图3所示，L-肉碱在220 nm附近存在一个吸收峰。含L-肉碱的样品在特征波长条件下的色谱图杂质峰较少，峰形尖锐对称，所以选择220 nm作为L-肉碱的检测波长。

2.3 标准曲线的制作

为了验证L-肉碱在流动相Ⅳ：乙腈-辛烷磺酸钠（50 mmol/L，pH）（体积比为25∶75）体系中的线性关系，配制了浓度为 1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、20.0 μg/mL 的系列标准溶液。试验结果表明，L-肉碱在1.0 μg/mL～20.0 μg/mL 内均具有良好的线性关系（r2＞0.99）；采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据色谱峰的性噪比（S/N）大于3倍确定检出限（LOD），S/N大于10倍确定定量限（LOQ），得到L-肉碱组分的LOD为0.1 mg/kg，LOQ 为 0.3 mg/kg，结果见表 1。

2.4 样品前处理条件的优化

根据L-肉碱有较好的水溶性和醇溶性的特点，试验比较甲醇、乙醇、1.0 mmol/L盐酸溶液3种提取溶液的提取L-肉碱的提取效果。结果发现，与样品以不同比例混合的甲醇、乙醇提取液，杂质较多，无法与L-肉碱分离，色谱图中目标峰峰形拖尾，影响L-肉碱的分析；而1.0 mmol/L盐酸溶液与样品以1∶1（体积比）提取的样品，目标峰可与杂质完全分离，且峰形对称，可以作为运动饮料中L-肉碱的提取溶液。

固相萃取法以其集样品提取、浓缩、净化于一体，简化了操作步骤，减少了溶剂用量，提高了样品前处理效率而受到重视。比较不同的固相萃取柱对样品回收率的影响，结果表明L-肉碱在WCX固相萃取柱与HLB固相萃取柱中回收率不高，目标化合物在淋洗液中有检出，说明L-肉碱在WCX柱与HLB柱中是弱保留，净化效果不佳。采用MCX固相萃取柱，L-肉碱的回收率大于80%，因此选用MCX固相萃取柱可以起到净化富集的作用。

表1 L-肉碱的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of L-carnitine

2.5 加标回收与相对偏差

在以上试验的优化条件下，利用空白基质的样品进行加标回收率试验，在分别添加10、50、100μg/kg等3个梯度浓度的标准溶液，每个浓度平行测定5次，测定结果见表2。

表2 方法的回收率及相对标准偏差（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表2可见，L-肉碱的加标回收率为82.3%～84.1%，相对标准偏差（RSD）为1.9%～2.6%，表明本试验所建立的方法具有可靠的准确度和精密度。

2.6 实际样品的测定

应用本文所建立的方法，对市售不同类型的标称含有L-肉碱的运动饮料共10个批次进行测定，发现这10个批次运动饮料中都含有L-肉碱，但含量差别较大，范围在20 μg/kg～1160 μg/kg之间。如图 4 所示，是一款运动饮料中含有L-肉碱的色谱图。

图4 样品中L-肉碱的色谱图Fig.4 The chromatograms of L-carnitine in the sample

3 结论

本文建立一种固相萃取-高效液相色谱-PDA检测器检测运动饮料中L-肉碱的分析方法。结果表明，在pH3.0的流动相：乙腈-辛烷磺酸钠（50 mmol/L）（体积比为25∶75），L-肉碱能得到良好的基线分离，其峰型良好，出峰时间合适。在220 nm的检测波长下，样品经过1.0 mmol/L盐酸溶液与样品以1∶1（体积比）提取后，再处理采用MCX固相萃取柱净化后，可实现对目标物的有效提取和净化。样品中的L-肉碱的加标回收率能达到82.3%～84.1%，能满足检测目标物质的要求，可以准确快速有效地检测运动饮料中L-肉碱。

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Determination of L-Carnitine in Sports Drink by HPLC

ZHOU Wen-qing
（Jingdezhen Ceramic Institute，Jingdezhen 333000，Jiangxi，China）

A rapid and effective method was established for the determination of L-carnitine in sports drink by HPLC.After the sample was extracted by 1.0 mmol/L HCl，it concentrated and purified by MCX solid phase extraction column.The separation of targeted compound was performed on RP C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile：sodium octane sulfonate （50 mmol/L）（25 ∶75，volume ratio）as mobile phase，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of L-carnitine was in the range of 1.0 μg/mL-20.0 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999.The detection limit was 0.1 mg/kg and the quantitative limit was 0.3 mg/kg.The recovery rate was 82.3%-84.1%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sports drink；L-carnitine

2016-12-09

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.032

周文清（1980—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：运动人体科学。