二硫化碳染毒对大鼠肾脏的影响

瞿 力，欧三桃，贺红焰，刘 建△

(1.重庆市第五人民医院肾病内科 400062；2.西南医科大学附属医院肾病内科，四川泸州 646000；3.西南医科大学附属医院病理科，四川泸州 646000)

二硫化碳染毒对大鼠肾脏的影响

瞿 力1，2，欧三桃2，贺红焰3，刘 建2△

(1.重庆市第五人民医院肾病内科 400062；2.西南医科大学附属医院肾病内科，四川泸州 646000；3.西南医科大学附属医院病理科，四川泸州 646000)

目的 探讨二硫化碳(CS2)染毒对大鼠肾脏的损害特点及其可能的发生机制。方法 80只SD大鼠随机分为对照组(A组)及0、50、150 、250 mg/kg CS2染毒组(B、C、D、E组)，每组16只。分别在染毒12、16周末两个时间点留取每组 6只大鼠的尿液，检测尿蛋白/肌酐、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)；留取血液检测肾功能；观察各组大鼠肾脏病理改变、肾小管上皮细胞凋亡及肾脏Bax蛋白表达情况。结果 在12、16周末，大鼠尿NAG活性在各染毒组明显增加(P<0.05)，且随CS2染毒剂量增加而增加；尿蛋白/肌酐无明显变化(P>0.05)。16周末血尿素氮(BUN)和肌酐水平在D、E组均升高，且E组升高更明显(P<0.05)。HE染色结果显示CS2染毒主要损害肾小管，呈局灶性颗粒空泡变性，呈剂量-效益关系。肾小管上皮细胞凋亡数目随CS2染毒剂量增加和染毒时间延长而增加，凋亡细胞在12周末时主要出现在近端小管上皮细胞，而16周末时则主要出现在远端小管上皮细胞。免疫组化显示随染毒剂量增加和染毒时间延长，染毒组肾小管上皮细胞质Bax蛋白染色程度加深及面积增大。结论 CS2染毒可导致大鼠肾脏结构和功能的损害，细胞凋亡可能是CS2致肾脏损害的机制之一。

二硫化碳；大鼠,Sprague-Dawley；肾损害；细胞凋亡；Bax

二硫化碳(carbon disulfide,CS2)对神经、心血管、生殖等系统均有毒性作用[1]，而国内外有关CS2对肾脏毒性研究文献报道不多，一系列流行病学调查[2-5]及动物实验[6-9]均提示CS2对肾功能有损害且损害可能有累积作用，但未进一步阐明其损害的程度及发生机制。2014年作者收治了国内某化纤厂10例长期接触CS2的作业工人，肾活检病理示肾小管损害较为突出，且部分患者肾小球呈糖尿病肾病结节样增生改变,与2000年Klemmer等[10]报道的个案类似。本研究通过CS2腹腔染毒动物模型，探究CS2对肾脏损害的特点及其可能的机制，为防护和治疗CS2中毒提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：80只雄性SD大鼠，由西南医科大学实验动物中心提供，体质量(211.4±11.0)g。(2)主要试剂：CS2分析纯由四川成都科龙化工试剂厂提供；橄榄油由西班牙品利公司提供。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)试剂盒购于北京诚林生物科技有限公司；原位末端标记(TUNEL)试剂盒购于瑞士Roche公司；Bax多克隆抗体购于美国Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 CS2染毒动物模型的建立及动物分组 将80只雄性SD大鼠分为对照组(A组)及0、50、150、250 mg/kg CS2染毒剂量组(B、C、D、E组)，每组16只。将CS2按比例溶于橄榄油中，每天腹腔注射染毒1次，每周5天，连续16周。B组予以等量的橄榄油腹腔注射，对照组不予以任何处理。于染毒12、16周末，收集尿液。然后用1%戊巴比妥钠溶液(4 mL/kg)麻醉，迅速采血，随之开腹，迅速取出肾脏组织并称质量，测定肾脏指数[肾脏质量(g)/体质量(kg)]，将肾脏置于4%多聚甲醛液中固定，常规石蜡包埋。

1.2.2 尿蛋白/肌酐的测定 采用考马斯亮蓝比色法测定尿蛋白水平，苦味酸法测定尿肌酐。

1.2.3 尿NAG及肾功能检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠尿样中NAG的活性，肾功能的检测采用全自动生化分析仪检测。

1.2.4 HE染色光镜检查 大鼠肾脏组织石蜡切片，行HE染色，光镜下观察肾组织的病理改变。

1.2.5 肾小管上皮细胞凋亡的检测 采用TUNEL法，按试剂盒(Roche)的操作说明，常规石蜡包埋切片预处理后，加入蛋白酶K溶液，于室温水解30 min，1.8%过氧化氢封闭。在切片上加20～50 μL Tunel反应混合物，于37 ℃反应60 min，中性树胶封片。

1.2.6 肾组织Bax蛋白免疫组织化学检测 石蜡切片常规脱蜡，入水后经一抗Bax多克隆抗体的酶标亲和素-生物素复合物法(SP法)免疫组织化学染色，DAB显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。细胞质出现黄色或棕黄色颗粒者为Bax蛋白阳性表达，采用图像分析软件Image-Pro-Plus 6.0(IPP 6.0)进行半定量分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠存活率和一般状况比较 染毒16周末，A、B、C、D、E组组存活率分别为100.00%、100.00%、87.50%、81.30%、75.00%。最终每组12只大鼠用于实验，12、16周末每组各6只。A、B组大鼠活动正常；各染毒组大鼠染毒早期主要表现为活动增多、攻击性强等；中期主要表现为兴奋性下降，随之毛发蓬乱而无光泽，肌张力下降，步态异常等；染毒结束时C组大鼠表现为后肢无力，E组则出现明显的步态异常，D组介于上述两组之间。

表1 各组大鼠体质量及肾脏指数比较±s，n=6)

a：P<0.05，与A、B组同期比较；b：P<0.05，与C组同期比较。

2.2 各组大鼠体质量、肾脏指数、尿液指标及肾功能比较 与A、B组大鼠同时间点比较，12、16周末D、E组大鼠体质量明显下降而肾脏指数明显增加，E组变化最明显(P<0.05)；与C组上述指标比较，E组体质量下降及肾脏指数增加明显(P<0.05)，见表1。各染毒组尿NAG活性明显增加，且随染毒剂量增加呈增加趋势(P<0.05)；各染毒组大鼠尿量及尿蛋白/肌酐水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。各组大鼠12周末血清Scr和BUN水平变化不明显(P>0.05)；16周末D、E组BUN、Scr升高明显，且E组升高最明显(P<0.05)；各染毒组大鼠UA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2 各组大鼠尿液指标比较

a：P<0.05，与A、B组同期比较；b：P<0.05，与C组同期比较;c:P<0.05，与D组同期比较。

2.3 各组大鼠肾组织HE染色结果比较 A、B组大鼠肾小球及肾小管形态结构清晰完整，无明显病理改变；12周末C、D组大鼠肾组织未见明显损伤，E组可见轻度的肾小管上皮细胞局灶性颗粒空泡变性。16周末随CS2染毒剂量的增加，C、D、E组出现不同程度的肾小管上皮细胞局灶性颗粒空泡变性。

表3 各组大鼠肾功能相关指标比较±s，n=6)

a：P<0.05，与A、B组同期比较；b：P<0.05，与C组同期比较。

a：P<0.05，与A、B组同时间点比较；b：P<0.05，与C组同时间点比较；c：P<0.05，与D组同时间点比较。

图1 各组大鼠肾细胞凋亡指数比较

2.4 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数比较 A、B组可见少量凋亡细胞，同一时间C、D、E组随CS2染毒剂量增加，细胞核可见呈棕褐色的凋亡细胞，凋亡细胞数目明显增多(P<0.05)。其中，凋亡细胞主要表达于肾小管，12周末染毒组凋亡细胞主要位于近端小管上皮细胞；16周末时染毒组主要表达于远端小管上皮细胞核。各组大鼠肾细胞凋亡情况，见图1。

图2 各组大鼠肾组织Bax的表达(免疫组化×200)

2.5 各组大鼠肾组织 Bax蛋白的表达比较 A、B组大鼠的肾组织中基本上未见Bax阳性细胞。在同一时间时，C、D、E组Bax阳性细胞主要表达于近端小管上皮细胞。C、D、E组Bax蛋白的平均光密度值比A、B组明显增多(P<0.05)，且E组值最大(P<0.05)，C组值最小，D组介于二者之间。各组大鼠肾组织Bax的表达，见图2。

3 讨 论

CS2职业中毒主要通过呼吸道，但动物经吸入染毒引发的肾脏损害一般较轻，并且具有难以控制染毒剂量，染毒设备要求高等缺点。灌胃染毒主要损伤肝脏[11]，CS2经腹腔染毒后，在体内吸收快，生物利用度高。由于造成CS2作业工人损害的主要是慢性低浓度中毒[4-5，12]，因此本研究在前期预实验的基础上，选择CS250、150、250 mg/kg 3个染毒剂量组，通过改变染毒方式及延长染毒时间对大鼠染毒，进一步探索CS2对肾脏的损害作用。

本研究结果显示，在其他肾功能指标无明显异常时，各染毒组尿NAG明显增加，并呈现剂量-效益关系，提示CS2慢性染毒可致大鼠肾脏损害，且以损害近端小管上皮细胞主。在12、16周末，尿蛋白/肌酐随染毒剂量增加变化不显著，提示大鼠肾近端小管上皮细胞有一定损伤，但尚未影响其肾小球功能，与陈炯等[9]研究结果相似。CS2导致的肾脏损害中，尿NAG改变较尿蛋白/肌酐明显，表明肾小管受损早于小球，且比肾小球更加敏感。与病理形态学上肾小球形态结构基本正常，肾组织的病理损伤主要在肾近端小管上皮细胞，并随染毒剂量增加和染毒时间延长，病理改变越重相吻合。与文献[13-14]的研究结果相似。在延长染毒时间及增加染毒剂量情况下，动物实验仍未出现类似人体CS2中毒的肾小球病变(类糖尿病肾病的结节样增生)[10,15]，推测CS2导致的肾脏损害可能存在种属差异。

本实验中发现C、D、E组肾脏细胞凋亡数目明显增多，说明肾组织中存在细胞凋亡。Bax蛋白表达明显增加，且在不同染毒组Bax蛋白表达的强度存在差异，说明肾脏受损可能是通过调节Bax蛋白表达量来调节大鼠肾脏细胞凋亡数目的。16周末时CS2染毒组近端小管上皮细胞Bax表达明显，可能是CS2产生过多的自由基，促进Bax表达升高，从而诱导了线粒体途径的凋亡。但12周末时Bax表达不明显，可见肾脏损害尚处于早期，其引起的细胞凋亡还未进入终末阶段。进一步实验结果表明，CS2染毒组12周末时凋亡细胞出现在近端小管上皮细胞，而16周末时在远端小管，与Bax蛋白的表达不一致。可能是TUNEL表达主要在凋亡的早期阶段，而Bax显示的是凋亡的终末执行阶段。上述结果提示CS2诱导的肾脏损害早期在近端小管，逐渐发展到远端小管，但不能排除非线粒体及其他途径所致早期损伤凋亡，有待进一步的实验验证。

CS2致肾脏损害的机制目前尚不完全清楚，本研究结果表明在CS2中毒性肾病中细胞凋亡起重要作用，细胞凋亡相关基因Bax可能参与了肾脏损害的病理过程。这为临床上职业性CS2中毒相关性肾病的发病机制提供了新的思路和实验理论依据。

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瞿力(1988-)，住院医师，硕士研究生，主要从事肾小球疾病基础与临床的研究。△

，E-mail:liujianhhy@sina.com。

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.035

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1671-8348(2017)18-2551-04

2017-01-12

2017-03-16)