UC患者PBMC中TLR4、NF-κB水平的变化及其临床意义

马永刚，高芙蓉，卞 巍

(1.武警浙江省总队医院嘉兴医院消化内科，浙江嘉兴 314000；2.武警浙江省总队医院嘉兴医院放射科，浙江嘉兴 314000；3.浙江省嘉兴市妇幼保健医院放射科 314000)

UC患者PBMC中TLR4、NF-κB水平的变化及其临床意义

马永刚1，高芙蓉2，卞 巍3

(1.武警浙江省总队医院嘉兴医院消化内科，浙江嘉兴 314000；2.武警浙江省总队医院嘉兴医院放射科，浙江嘉兴 314000；3.浙江省嘉兴市妇幼保健医院放射科 314000)

目的 探讨溃疡性结肠炎(UC)患者外周血单核细胞(PBMC)中TOLL样受体(TLR)4、NF-κB水平的变化及在UC发病中的可能机制。方法 选取武警浙江省总队医院嘉兴医院消化科2014年1月至2015年1月收治的UC患者30例作为观察组，另选取该院体检科健康体检者10例作为对照组。采用流式细胞仪检测外周血 CD14+单核细胞表面 TLR4阳性表达率，RT-PCR检测TLR4、髓样分化因子88(MyD88)、NF-κB(P65) mRNA 表达水平，Western blot检测TLR4、MyD88、NF-κB(P65) 蛋白水平。结果 观察组外周血 CD14+单核细胞表面 TLR4 阳性表达率明显高于对照组(P<0.05)；对照组TLR4、MyD88、NF-κB(P65) mRNA及蛋白水平明显低于观察组(P<0.01)；TLR4、MyD88、NF-κB(P65) 蛋白水平与UC严重程度呈正相关。结论 UC患者PBMC中TLR4、NF-κB明显增高，临床可通过检测TLR4、NF-κB水平判断UC的发展程度。

结肠炎，溃疡性；单核细胞；TOLL样受体4；NF-κB

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的一种，临床主要表现为反复的腹痛、腹泻、黏液血便、里急后重等，严重者可导致失血性休克[1]。UC 的发病机制与遗传、感染、免疫异常、心理及环境等因素有关。目前的研究认为人体免疫功能的紊乱可能是UC病情发生、发展的主要影响因素，而TOLL样受体(toll-like receptors，TLRs)可能与UC密切相关[2-3]。TLRs可启动由髓样分子因子88(MyD88)介导的NF-κB下游炎症反应信号通路[4-6]。本研究比较健康者和UC患者TLR4、NF-κB表达水平的差异，探讨TLR4、NF-κB在UC发病中的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择武警浙江省总队医院嘉兴医院消化内科2014年1月至2015年1月收治的UC患者30例作为观察组，其中男16例，女14例，年龄29～63岁，平均(40.82±8.32)岁，病程3个月至12年，平均(4.35±0.83)年。30例UC患者依据病情严重程度分为轻度组(n=8)、中度组(n=12)、重度组(n=10)。另选取该院体检科正常体检者10例作为对照组，其中男5例，女5例，年龄30～64岁，平均(35.02±11.22)岁，两组对象性别、年龄比较，差异无统计学差异(P>0.05)。所有对象均签署了知情同意书，对试验内容了解。本研究获得该院伦理委员会批准。30例UC患者均符合2007年5月济南全国IBD研讨会修订的《对我国IBD诊断治疗规范的共识意见》中的诊断标准。患者排除具有其他自身免疫性疾病，排除结核、肝炎、肿瘤等疾病，排除细菌性痢疾、阿米巴痢疾、慢性血吸虫病、肠结核等感染性结肠炎。UC的分级标准参考《对我国IBD诊断治疗规范的共识意见》，轻度：腹泻低于4次/天，便血轻或无，无发热、脉搏加快或贫血，红细胞沉降率(ESR)正常。中度：腹泻次数4～6次/天，便血轻中度。重度：腹泻每天 6 次以上，伴明显黏液血便，体温高于 37.5 ℃，脉搏每分钟90次以上，血红蛋白(Hb)<100 g/L，ESR>30 mm/ h[7]。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2 方法

1.2.1 主要仪器和试剂 T Gradient型PCR 仪(Biometra公司)；GIS 凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)；冷冻高速离心机(德国Eppendor公司)；琼脂糖水平电泳槽(北京六一仪器厂)；超低温冰箱(日本三洋公司)；PCR 扩增试剂盒(Fermentas公司)；PCR 引物(上海生物工程有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；流式细胞仪(美国Becton dickinson公司);CD14-FITC(Miltenyi公司)。

1.2.2 标本采集及检测方法 两组对象均于清晨空腹采集静脉血液，肝素抗凝，3 000 r/min分离获得血浆，-80 ℃保存待测。利用密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种于24孔板，细胞培养4 h后，洗脱未贴壁的细胞，获得贴壁的PBMC。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后收获细胞。采用双色荧光法进行 CD14+单核细胞上 TLR4 阳性率的检测，用 Cell Quest 软件进行获取和分析数据[8]。100 μL细胞悬液(5×105个/mL)，加入CD14-FITC，CD284-APC抗体各 10 μL，4 ℃避光孵育 30 min，PBS清洗2次，加入 300 μL PBS上机检测。RT-PCR检测：提取单核细胞RNA，依次加入RNA、Oligo(dT18)、双蒸水，总体积为12.50 μL,65 ℃ 5 min，冰浴5 min，加入RNase 抑制剂、Buffer、d NTPs、M-Mu LV，42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min，冰浴 5 min，RT-PCR以 GAPDH 为作为内参基因，实时荧光试验结果采用 2-ΔΔCT的数据统计方法分析基因的相对表达。引物序列见表1[9]。Western blot检测：胰酶消化离心获得细胞，加入冰预冷裂解缓冲液，高速冷冻离心机离心获得蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿法转膜，封闭处理，加入抗体孵育，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温下孵育 2 h，将显影液置于NC 膜上，凝胶成像仪成像。

2 结 果

2.1 两组对象外周血CD14+单核细胞表面TLR4阳性表达比较 对照组外周血CD14+单核细胞表面TLR4阳性表达率为(0.09±0.02)%，观察组外周血CD14+单核细胞表面TLR4阳性表达率为(1.80±0.06)%，观察组外周血CD14+单核细胞表面TLR4阳性表达率明显高于对照组(P<0.05)。

2.2 两组对象PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65) mRNA表达水平比较 对照组TLR4、MyD88、NF-κB(P65) mRNA水平明显低于观察组(P<0.01)，见表2。

表2 两组对象PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65) mRNA表达水平比较

a：P<0.01，与对照组比较。

2.3 两组对象PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65) 蛋白水平比较 对照组TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白水平明显低于观察组(P<0.01)，见表3。

表3 两组对象PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65) 蛋白水平比较

a：P<0.01，与对照组比较。

2.4 UC不同组别PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表达水平比较 TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表达水平与UC严重程度呈正相关，UC重度组TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表达明显高于UC轻、中度组(P<0.01)；UC中度组TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表达明显高于UC轻度组(P<0.01)，见表4。

表4 UC不同组别PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表达水平比较

a：P<0.01，与UC重度组比较；b：P<0.01，与UC中度组比较。

3 讨 论

UC是IBD的一种，是病因未明的、以侵犯结肠为主的慢性炎症，该病病程长、易复发、与直结肠癌的发病有着重要联系。西方国家，UC发病率为7/10万人[10]；亚洲，UC发病率为1～2/10万人。UC的发病机制尚未明确，环境、遗传、感染和免疫因素相结合导致肠道黏膜炎症，然后黏膜病变，黏膜修复。尽管发病机制尚未明确，机体免疫系统对肠道正常菌群的免疫反应异常是其发病的重要因素[11]。

哺乳动物中已发现的TLRs有13种，其中，人类至少有10种。TLRs表达在各种免疫细胞上，其中TLR4主要表达于单核-巨噬细胞、树突状细胞表面，TLR4通过选择性识别PAMPs[如脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白和微生物核酸等],触发MyD88依赖性和非依赖性途径，最终活化NF-κB，导致肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等炎性细胞因子及趋化因子的释放，诱导炎症的发生[12-13]。TLR4识别的外源性配体主要为脂多糖，内源性配体主要包括坏死细胞、热休克蛋白等。活化的通过信号转导介导肠道黏膜的免疫反应[14]。

本研究比较了健康者与UC患者之间PBMC的TLR4、MyD88和NF-κB(P65)表达差异，UC患者TLR4、MyD88和NF-κB(P65)无论在基因水平还是蛋白水平均明显高于对照组，说明TLR4和NF-κB(P65)与UC的发病相关。TLR4表达异常可能与LPS耐受有关，UC肠道菌群失调，宿主肠黏膜对LPS的耐受性降低，外周血TLR4大量表达，并与LPS结合，激活TLRS-MyD88-IRAK-NF-κB(P65)的转导途径，募集炎性细胞，释放自由基，损伤黏膜[15]。在进一步的分析中，TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表达水平与UC严重程度呈正相关，表明TLR4、MyD88和NF-κB(P65)表达水平可反映UC的活动情况，有助于判断患者的病情发展情况。

综上所述，TLR4、MyD88和NF-κB(P65)参与了UC的发生、发展，临床可通过检测TLR4、MyD88和NF-κB(P65)水平判断UC患者的疾病发展情况，并将信号通路作为UC的潜在治疗靶点。

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Changes and clinical significance of TLR4 and nuclear factor kappa B in peripheral blood mononuclear cells of patients with ulcerative colitis

MaYonggang1,GaoFurong2,BianWei3

(1.DepartmentofInternalMedicine;2.DepartmentofRadiology,JiaxingHospitalofZhengjiangProvincialArmedPoliceCorpsHospital,Jiaxing,Zhejiang314000,China;3.DepartmentofRadiology,JiaxingMaternalandChildHealthCareHospital,Jiaxing,Zhejiang314000,China)

Objective To investigate the changes of TLR4 and nuclear factor kappa B(NF-κB) levels in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of the patients with ulcerative colitis(UC) and its possible pathogenesis mechanism.Methods In our hospital from January 2014 to January 2015,30 cases of UC were selected as the observation group,and other 10 individuals undergoing healthy physical examination in this hospital were selected as the control group.Flow cytometry was used to detect the positive expression rate of TLR4 on surface of peripheral blood CD14+mononuclear cells.The levels of TLR4,MyD88,NF-κB(P65) mRNA expression were detected by RT-PCR.Western blot was adopted to detect the levels of TLR4,MyD88,NF-κB(P65) protein.Results The positive expression rate of TLR4 on the surface of peripheral blood CD14+mononuclear cells in the observation group was significantly higher than that in the control group(P<0.05);the levels of TLR4,MyD88 and NF-κB(P65) B mRNA and protein in the control group were significantly lower than those in the observation group(P<0.05);the levels of TLR4,MyD88 and NF-κB(P65) protein were positively correlated with the severity of UC.Conclusion The levels of TLR4 and NF-κB in PBMC of the patients with UC are significantly increased,clinic can judge the UC development degree by detecting TLR4 and NF-κB levels.

colitis,ulcerative;monocytes;toll-like receptor 4;NF-kappa B

马永刚(1975-)，主治医师，本科，从事消化内科疾病的诊治研究。

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.023

R574.1

A

1671-8348(2017)18-2515-03

2017-01-01

2017-03-16)