微创清除颅内血肿降低病灶周围组织谷氨酸水平及BBB通透性*

李 昌，唐翠娥，付 蓉，王丽琨，伍国锋△

(1.贵州省贵阳市第二人民医院神经内科 550081；2.贵州医科大学计算机教研室，贵阳 550004；3.贵州医科大学神经病学教研室，贵阳 550004)

微创清除颅内血肿降低病灶周围组织谷氨酸水平及BBB通透性*

李 昌1，唐翠娥2，付 蓉1，王丽琨3，伍国锋3△

(1.贵州省贵阳市第二人民医院神经内科 550081；2.贵州医科大学计算机教研室，贵阳 550004；3.贵州医科大学神经病学教研室，贵阳 550004)

目的 探讨微创颅内血肿清除对降低病灶周围脑组织谷氨酸(Glu)水平、血脑屏障(BBB)通透性及脑水肿的影响。方法 将30只体质量2.80～3.40 kg的家兔制作自发性脑出血(ICH)模型，模型制作成功后，分成对照组(MC组)和微创组(MI组)，MI组于造模后6 h内通过立体定向仪行微创颅内血肿清除术，于术后1、3、7 d提取脑组织，检测血肿周围脑组织Glu水平、BBB通透性及脑含水量，并与对照组进行比较分析。结果 MI组在术后1、3、7 d血肿周围脑组织Glu水平、BBB通透性及脑含水量均低于MC组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 微创技术清除颅内血肿有利于降低血肿周围Glu水平、BBB透性及脑含水量。

脑出血；微创技术清除颅内血肿；谷氨酸；血脑屏障；脑含水量

自发性脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后由于血肿本身对周围脑组织的机械压迫及炎症介质、兴奋性氨基酸等神经毒性物质的释放导致了继发性脑损害，在血肿附近的脑组织发生不可逆的损害[1]，而谷氨酸(Glu)介导的兴奋性毒性作用可能对继发性脑损害有重要影响[1]。近年来，微创清除颅内血肿的有效性已经得到临床研究证实[2]；但是，关于微创外科手术清除颅内血肿后对病灶周边脑组织神经化学变化和血脑屏障(BBB)通透性的变化依然有待进一步研究，对于病灶周围脑组织在清除血肿后的病理生理改变少有报道。本课题组以Glu、BBB通透性和脑含水量为观察指标，探讨微创技术清除颅内血肿后血肿周围脑组织Glu水平的变化和BBB通透性与脑含水量的关系。

1 材料及方法

1.1 材料 (1)动物：大耳白兔42只，由贵州医科大学动物实验中心提供，体质量2.80～3.40 kg，雌雄不分。(2)主要仪器：兔脑立体定位仪(ZH-蓝星B型，淮北正华生物仪器设备有限公司)；电子天平(Satourious德国)；光栅分光光度计(彩虹722型，山东高密彩虹分析仪器有限公司)；5415R高速离心机(冷冻型，Heraeus公司)；202-2型电热恒温干燥箱(上海路达实验仪器有限公司)；数显恒温水浴锅HH-2(国华电器有限公司)；-80 ℃低温冰箱(Forman Scientific公司)；高效液相色谱仪(HP-1100，美国Agilent Technologies)；G1315A二极管阵列检测器(DAD,美国Agilent Technologies)；pH计(410A型，美国ORION)；安捷伦1313A自动进样器(美国Agilent Technologies)；柱温箱(美国Agilent Technologies)。(3)主要试剂：甲酰胺(HCONH2，重庆川江化学试剂厂)；乌拉坦(C3H7NO2，无锡阳山生化有限责任公司)；伊文思蓝(EB，北京恒业中远化工有限公司)；4%多聚甲醛溶液(博士徳生物工程有限公司)；尿激酶(广东丽珠公司)；氨基酸标准品(Sigma公司)；衍生化试剂(硼酸盐缓冲液)、FMOC试剂(安捷伦PN5061-3337)、OPA试剂(安捷伦PN5061-3335均为美国Agilent Technologies公司产品；2,4-二硝基氟苯(日本)；乙腈、甲醇色谱纯(德国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将30只大耳白兔制作ICH模型，并分为模型对照组(MC 组)和微创组(MI 组)，每组各15只，再把每组15只动物在组内再平均分成3组(分别于模型制作成功后第1、3、7天处死)，MI组全部动物在模型制作成功后6 h内行微创血肿清除术。将另12只健康大耳白兔，平均分为3组，分别于第1、3、7天处死作为正常对照组(NC 组)。

1.2.2 制作ICH模型 动物模型制作前12 h禁食、4 h禁水，乌拉坦(5 mL/kg)麻醉后固定于兔脑立体定向仪，取兔两眼眶后缘连线正中线做长约3.0 cm皮肤切口，随即分离至骨膜，参照兔脑立体定向图谱确定基底节区位置，从家兔耳中央动脉取自体未凝血，在兔脑立体定向仪的引导下缓慢注入未凝自体动脉血0.5 mL到右侧基底节区注血时间3 min以上,保持针头于原位8 min后再逐渐退针。造模3 h后行头颅CT检查,基底节区有高密度影且未破入脑室者提示造模成功。将通过CT扫描提示造模成功的大耳白兔(图1)送入动物房饲养，所有实验动物均在静脉注射乌拉坦后5 h内清醒。

1.2.3 微创颅内血肿清除术的手术步骤 MI组动物均在ICH模型制作成功后6 h内行微创颅内血肿清除术，沿原穿刺孔作为微创手术进针的部位，向原穿刺点注入尿激酶5 000 U(溶于0.5 mL生理盐水中)，针头固定原位15 min后开始缓慢抽吸，边抽吸边缓慢退针。复查头颅CT,见血肿基本清除后(图2)。MC、NC组仅行外科进针程序，不作其他处理。

图1 CT见右侧基底节区血肿形成

1.2.4 采集标本 处置动物后快速断头取脑，取血肿周围5 mm内脑组织置于冰盘，以针道为中心，将脑组织分为4部分(即前内、前外、后内、后外)，前外侧部分用于测EB水平，前内侧部分立即放入-80 ℃冰箱用于Glu水平检测，后内侧用于测量脑含水量。

图2 复查头颅CT见血肿消失

1.2.5 高校液相色谱分析测定血肿周围Glu水平 色谱柱为ZORBAX clipse-AAA(4.6×150 mm,5 μm);流动相A:40 mmol/L Na2HPO4，pH7.8[5.5 g NaH2PO4(含1分子水)+1 000 mL水，用(10N)NaOH溶液调pH至7.8]，流动相B为ACN∶MeOH∶水(45∶45∶10，V/V/V)。流速为2 mL/min；梯度：0～<18.1 min，B从0上升至57%,18.1～<18.6 min，B从57%上升至100%,18.6～<22.3 min，B维持100%,22.3～<23.2 min，B从100%下降至0%。23.2～26 min,B仍然在0%。柱温为40 ℃,进样量为10 μL,二极管阵列检测器(DAD)波长262 nm,参比波长324 nm。在1 mL甲醇中加入邻苯二甲醛(OPA)25 mg，使其充分溶解后再加入0.4 mol/L硼酸氢二钠、硼酸二氢钠缓冲溶液(pH 10.4) 5 mL,混匀，置于4 ℃冰箱备用。称取氨基酸标准品适量，用0.2 mol/L 碳酸氢钠(NaHCO3，pH 9.8) 配制成浓度为1.0 g/L的标准储备液。解冻脑组织，电子天平称重后放入干燥玻璃匀浆器中，加0.1 mmol/L稀盐酸1∶5(W/V)，超声粉碎(温度：4 ℃，脉冲：运行2 s，停5 s；强度：20%，共15次)。离心(12 000 r/min，20 min,4 ℃)后，取2.5 μL硼酸缓冲液加入0.5 μL样品上清液溶液，混合30 s,加入OPA 0.5 μL混合30 s后加入0.5 μL的FMOC混合30 s,加入32 μL水，混合30 s，进样10 μL。通过色谱工作站积分氨基酸的峰面积，外标法定量，计算氨基酸浓度，再根据标质量可得出每克脑组织氨基酸浓度。

1.2.6 BBB通透率的测定 (1)采用EB作为示踪剂检测BBB的通透性。在各实验点前2 h，经兔耳缘静脉按2 mL/kg注入2% EB，循环2 h后,迅速提取脑组织，取血肿周围脑组织用电子天平(精确到0.1 mg)称质量，随之把它放入盛有4 mL甲酰胺的试管中，放入54 ℃恒温箱水浴24 h,离心后分光光度计(λ= 632 nm) 测定上清液吸光度,滤光波长为632 nm，甲酰胺为空白对照。(2)标准曲线的建立：电子天平(精确度0.1 mg)称取EB 4 mg放入玻璃容器中，缓慢加入生理盐水至总容积到100 mL，摇匀后用玻璃吸管取0.3 mL，加入5.7 mL甲酰胺配制成第1管标准液，再从第1管标准液中取3 mL加3 mL甲酰胺溶液配制成第2管，据此法依次配置7管标准液，则这7管标准液每毫升所含EB依次为8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg,加盖橡皮塞，放入54 ℃恒温水浴箱水浴24 h。然后用上述相同方法测量吸光度，求出它们与EB水平的直线回归方程：Y=0.005 3X+0.060 8(R2=0.983 3) EB标准曲线,反映吸光度(A)与EB水平的关系。(3)脑组织EB水平计算方法：采用甲酰胺法测定脑组织EB水平以判定BBB的破坏程度。脑组织EB水平(μg/g湿脑)=B×甲酰胺量(mL)/脑组织湿质量(g)，公式中的B是根据标准曲线的直线回归方程求得的样本EB水平(μg/mL)。(4)脑组织含水量的测定：提取兔脑组织后先用电子天平称取湿质量，随后放入100 ℃电热恒温干燥箱，48 h后取出称其干质量，脑组织含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

2 结 果

2.1 家兔ICH制模情况 本实验成功制作出30只家兔ICH模型，其中MC组在实验模型制作成功后不明原因死亡1只；MI组在制作模型时因乌拉坦注射过量死亡2只，模型制作成功后第5天死亡1只。最后MC组及MI组各以12只家兔来进行对比观察。

2.2 各组家兔脑组织Glu水平比较 MI组家兔血肿周围脑组织Glu水平在各时间点明显少于MC组(P<0.05),MC组在各时间点明显高于NC组(P<0.05)；MI组在第1、3天明显高于NC组(P<0.05)，但第7天与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组家兔脑组织Glu水平比较

a：P<0.05，与NC组比较；b：P<0.05，与MC组比较P<0.05。

2.3 各组家兔BBB通透性比较 MI组家兔血肿周围脑组织EB水平在各时间点明显少于MC组(P<0.05)，MC组和MI组各时间点EB水平均高于NC组(P<0.05)，见表2。

表2 各组家兔脑组织EB水平比较

a：P<0.05，与NC组比较；b：P<0.05，与MC组比较P<0.05。

表3 各组家兔组织含水量比较

a：P<0.05，与NC组比较；b：P<0.05，与MC组比较P<0.05。

2.4 各组家兔脑组织含水量比较 MI组家兔在各时间点血肿周围脑组织含水量均明显低于MC组(P<0.05)，且MC组和MI组血肿周围脑组织含水量在各时间点均高于NC组(P<0.05)，见表3。

3 讨 论

ICH占卒中患者的10%～15%，具有高伤残率和高死亡率，目前治疗主要是针对原发性损害和防止再出血，但所有这些治疗都不能有效地减少致残率和死亡率[3]。继发性脑损伤是ICH预后不良的重要因素，Glu在继发性脑损伤中起着重要作用[1]。有研究发现ICH后血肿周围脑组织Glu水平明显增高，而兴奋性氨基酸水平与其预后密切相关[4-5]，Glu水平越高其预后越差[6]。血肿周围脑组织Glu水平升高可导致BBB破坏，BBB通透性增加可加重脑水肿，如Glu的兴奋性毒性作用被拮抗则可能减少BBB通透性，减少脑水肿。在实验性蛛网膜下腔出血和弥漫性脑损伤中用Glu受体拮抗剂MK-801后有助于BBB通透性的恢复，有利于减轻脑水肿[7]；研究表明在不影响血肿体积的情况下，用免疫方法阻断Glu NMDA受体，可明显减少脑水肿和神经元细胞坏死，并有利于减少神经功能缺陷[8]。本实验中，经微创技术清除颅内血肿后，血肿周围脑组织Glu水平明显下降，血肿的占位效应减少，从而减少BBB通透性及脑含水量。Miller等[9]学者也观察到血肿周围脑组织Glu水平增高，微创清除血肿后Glu水平降低。

BBB破坏导致脑水肿形成，ICH后释放的神经毒性物质，除凝血酶、血红蛋白对BBB的破坏外，Glu的兴奋性毒性作用也可能是脑水肿形成的重要因素[3]。动物鼠模型实验研究显示，蛛网膜下腔出血后细胞外Glu水平明显增加，而Glu转运体明显降低[10]。ICH后大量Glu释放，血肿周围能量代谢障碍，影响Glu/谷氨酰胺(Gln)比值、限制Glu的摄取，同时，细胞外兴奋性神经传递物质增加而Glu脱羟酶抑制，导致能量代谢失调和神经毒性物质增加损害BBB，因此，脑水肿与颅内血肿和BBB通透性密切相关。

通过测量不同时间点脑组织EB水平来判断BBB损害程度，有研究显示脑内注血后6 h BBB开始有受损，随着时间的推移逐渐加重，72 h达最高峰[8]，在本实验中除上述现象外，同时发现脑含水量也有同样的变化。

脑水肿是ICH后病情恶化的主要原因，ICH后如能尽早、有效地控制脑水肿，则可减少血肿周围神经元的继发性损害从而降低死亡率、减少致残率。血肿清除不但可以减轻脑水肿，还清除了血肿破坏后释放的凝血酶、Glu、基质金属蛋白酶、血红蛋白及其他降解产物对神经的毒害作用[11-12]，减少血肿对周围脑组织的压迫，改善局部微循环，加速Glu/Gln循环，促进Glu摄取，Glu在Glu脱羧酶作用下可以转变成γ-氨基丁酸，减少细胞外兴奋性神经递质，而减少脑水肿、降低BBB通透性。因此，超早期清除颅内血肿对减轻脑水肿和保护BBB有重要的意义[2、13]。

综上所述，微创清除颅内血肿有利于减少血肿周围脑组织Glu水平、减少BBB通透性，预防继发性脑损害的发展。

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Minimally invasive surgery for removing intracranial hematoma and decreasing perihematomal glutamate content and permeability of blood-brain barrier*

LiChang1,TangCuie2,FuRong1,WangLikun3,WuGuofeng3△

(1.DepartmentofNeurology,GuiyangMunicipalSecondPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550081,China;2.TeachingandResearchingSectionofComputer,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China;3.TeachingandResearchingSectionofNeurology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To investigate the effects of minimally invasive intracranial hematoma clearance on the perihematomal glutamate(Glu) level,permeability of blood-brain barrier(BBB) and brain edema.Methods Thirty rabbits with body weight of 2.80-3.40 kg were used to established the model of spontaneous intracerebral hemorrhage(ICH) and randomly divided into the minimally invasive group(MI) and control group(MC) after the model was prepared successfully.The MI group underwent minimally invasive procedures for removing intracranial hematoma by stereotactic instrument within 6 h after establishing the ICH model.The brain tissue was extracted on postoperative 1,3,7 d,and the perihematomal brain tissues were taken to detect the Glu level,BBB permeability and water content of brain tissue,which were compared with those in the control group.Results The Glu level,BBB permeability and brain water content on 1,3,7 d in the MI group were lower than those in the MC group,and the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion The minimally invasive surgery for removing intracranial hematoma is helpful to reduce perihematoma Glu level,BBB permeability and brain water content.

cerebral hemorrhage;minimally invasive surgery for removing intracerebral hematoma;glutamate;blood-brain barrier;brain water content

贵阳市卫生和计划生育委员会科学技术计划项目[(2015)筑卫计科技合同字第074号]；贵州省高血压性颅内出血微创诊疗科技创新人才团队。 作者简介：李昌(1976-)，副主任医师，硕士研究生，主要从事脑血管疾病和癫痫的诊治研究。△

，E-mail:wuguofeng3013@sina.com。

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.008

R743.34

A

1671-8348(2017)18-2471-04

2017-01-07

2017-03-11)