吸入麻醉药后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤影响的比较*

朱家军，王大亮，王永万，徐海龙，刘金东△

(1.灌云县人民医院麻醉科，江苏连云港 222200；2.徐州医科大学附属医院麻醉科，江苏徐州 221002)

吸入麻醉药后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤影响的比较*

朱家军1，王大亮2，王永万1，徐海龙1，刘金东2△

(1.灌云县人民医院麻醉科，江苏连云港 222200；2.徐州医科大学附属医院麻醉科，江苏徐州 221002)

目的 探讨七氟醚和异氟醚后处理在成年大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中的心肌保护作用。方法 将成年雄性SD大鼠24只，采用随机数字表法分为对照组(C组)、缺血再灌注组(R组)、七氟醚后处理组(S组)和异氟醚后处理组(I组)，每组6只。建立Langendorff离体心脏灌注模型。于平衡灌注末及再灌注30、90 min时记录心率(HR)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室发展压(LVDP)、左心室压力上升最大速率(LV+dp/dtmax)和左心室压力下降最大速率(LV-dp/dtmax)；灌注结束后，取心尖部心肌组织1 mm3，电镜下观察线粒体结构并评分，剩余心脏组织采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定心肌梗死面积(MIS)。结果 与R组比较，S组和I组心肌再灌注后的心功能指标改善，MIS减小，线粒体损伤减轻(P<0.05)；与S组比较，I组心肌再灌注后的心功能变差，MIS增大，线粒体损伤程度加重(P<0.05)。结论 七氟醚和异氟醚后处理在成年大鼠MIRI中均有保护作用，但七氟醚后处理的心肌保护作用优于异氟醚后处理。

心肌缺血；再灌注损伤；七氟醚后处理；异氟醚后处理；线粒体

随着经济发展，人口出现老龄化，冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌梗死等缺血性心脏病的发病率逐渐升高。经皮冠状动脉介入治疗术、急性心肌梗死溶栓术、冠状动脉旁路移植术等在缺血性心血管疾病的治疗中已广泛应用，随之发生的缺血再灌注损伤(IRI)引起医学界的关注[1]。 七氟醚、异氟醚是目前临床上常用的吸入麻醉药，在心肌再灌注之前七氟烷或者异氟烷可以减轻IRI[2-3]，而二者后处理在减轻心肌IRI(MIRI)的作用方面少见报道。本研究拟采用离体实验，比较七氟醚和异氟醚后处理在大鼠MIRI中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物来源与分组 成年雄性SD 大鼠24只，220～260 g，由济宁市鲁康动物饲料经销中心提供。用随机数字表法将大鼠随机分为4组，对照组(C组)、缺血再灌注组(R组)、七氟醚后处理组(S组)和异氟醚后处理组(I组)，每组6只。

1.1.2 药品、试剂和仪器设备 七氟醚(批号:16020331，上海恒瑞医药有限公司)，异氟醚(批号：217151201，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；七氟醚挥发罐(ANBON libs200)异氟醚挥发罐(Drager)，K-H 液(mmol/L:NaCl 8,KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2,CaCl22.5，NaHCO325，葡萄糖11.1，EDTA-2Na 0.125)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司，美国)。压力传感器(成都泰盟科技有限公司)；H-600透射式电子显微镜(日本日立公司)；LK&V超薄切片机(瑞典LKB公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠离体心脏缺血再灌注模型制作 参照文献[4]建立Langendorff大鼠离体心脏灌注模型。3%戊巴比妥30 mg/kg行大鼠腹腔注射麻醉，同时注射500 IU/mL肝素抗凝，快速打开大鼠胸腔取出心脏，将心脏置入预充氧的冷(0 ℃)K-H液中，去除主动脉根部多余组织，分离出主动脉，经主动脉逆行插管将心脏悬挂于Langendorff灌注装置上，以K-H液恒压灌注，将K-H 液用95%O2+5%CO2混合气体饱，同时使其温度和pH 值分别维持在(37.00±0.50)℃和7.40±0.05。C组连续灌注K-H液130 min；R组平衡灌注K-H液10 min后全心缺血30 min，K-H液再灌注90 min；S组平衡灌注10 min后全心缺血30 min，再用2.50%七氟醚预充的K-H液灌注15 min，随后K-H液再灌注75 min。I组平衡灌注10 min后全心缺血30min，再用1.50%异氟醚预充的K-H液灌注15 min后，再用K-H液再灌注75 min。

1.2.2 血流动力学测定 自制直径约3 mm的乳胶球囊，将其与压力传感器相连，随后将球囊经心脏左心耳处剪开的小口置入左心室腔内，向球囊内注射生理盐水，使得平衡灌注期左心室舒张末压(LVEDP)维持在0～10 mm Hg。传感器经模数转换器连接计算机，连续监测心率(HR)、LVEDP、左心室发展压(LVDP)、左心室压力上升最大速率(LV+dp/dtmax)和左心室压力下降最大速率(LV-dp/dtmax)，并于平衡灌注末(T1)及再灌注30 min(T2)和90 min(T3)时记录相关指标。

1.2.3 心肌线粒体超微结构观察 在再灌注结束后，切取心尖部组织1 mm3(剩余心肌置于-80 ℃冰箱保存备用)，经下列程序处理：戊二醛-四氧化锇固定液双固定、乙醇梯度脱水、环氧丙烷置换、环氧树脂浸透、包埋，做成1～2 pm半超薄切片，用亚甲蓝染色后光学显微镜下定位；超薄切片机制作50～70 nm超薄切片，经醋酸铀、柠檬酸铅染色后，透射式电子显微镜下观察线粒体超微结构，进行Flameng评分。评分方法：每个标本随机挑选5个视野，每个视野随机选4个线粒体(线粒体观察总数为20)进行损伤程度分级。 0级：线粒体无明显肿胀，超微结构正常，基质颗粒完好；1级：线粒体轻度肿胀，结构基本正常，线粒体嵴和基质超微结构正常，基质颗粒缺失；2级：线粒体中度肿胀，基质颗粒丧失，基质透明，线粒体嵴没有破坏；3级：线粒体严重肿胀，基质颗粒丧失，基质均匀透明，线粒体嵴断裂；4级：线粒体严重肿胀，基质颗粒丧失，线粒体嵴完全断裂，线粒体膜完整性丧失；从0～4级分别计0～4分。

1.2.4 心肌梗死面积测定 采用TTC染色测定心肌梗死面积。取冰箱中备用冰冻心肌标本，沿着垂直于心脏长轴的方向将心脏切为2 mm薄片4～6片，放入1%TTC磷酸盐缓冲液中(pH=7.40)，37 ℃水浴箱中闭光孵育10 min，存活心肌呈正常砖红色，梗死心肌呈灰白色。染色对比明显后留取图片。Image-J软件计算心肌梗死面积(MIS)，计算公式如下：

MIS=(MIS之和/总面积之和)×100%。

2 结 果

2.1 各组大鼠血流动力学比较 与C组比较，R、S、I组在T2、T3时HR、LVDP、LV+dp/dtmax和LV-dp/dtmax降低(P<0.05)，LVEDP升高(P<0.05)；与R组比较，S、I组在T2、T3时HR、LVDP、LV+dp/dtmax和LV-dp/dtmax均升高(P<0.05)，LVEDP均降低(P<0.05)；与S组比较，I组T2、T3时HR、LVDP、LV+dp/dtmax和LV-dp/dtmax降低(P<0.05)，LVEDP升高(P<0.05)，见表1、2。

2.2 各组大鼠MIS和线粒体超微结构Flameng评分比较 与C组比较，R、S、I组MIS增加(P<0.05)；与R比较，S、I组MIS减少(P<0.05)；与S组比较，I组MIS增加(P<0.05)。各组大鼠电镜心肌线粒体超微结构显示，电镜下见C组线粒体无明显肿胀、破裂(图1A)，而R组线粒体明显肿胀、破裂(图1B)，S、I组线粒体仅部分肿胀、破裂(图1C、D)，较R组有明显改善。与C组比较，R、S、I组线粒体损伤加重(P<0.05)；与R组比较，S、I组线粒体损伤减轻(P<0.05)； 与S组比较，I组线粒体损伤程度增加(P<0.05)。4组大鼠MIS和Flameng评分比较，见表3。

表1 各组大鼠各时间点HR、LVEDP及LVDP水平比较

a：P<0.05，与C组比较；b：P<0.05，与R组比较；c：P<0.05，与S组比较。

表2 各组大鼠各时间点LV-dp/dtmax及LV+dp/dtmax比较

续表2 各组大鼠各时间点LV-dp/dtmax及LV+dp/dtmax比较

a：P<0.05，与C组比较；b：P<0.05，与R组比较；c：P<0.05，与S组比较。

表3 各组大鼠MIS和Flameng评分比较

a：P<0.05，与C组比较；b：P<0.05，与R组比较；c：P<0.05，与S组比较。

A：C组；B：R组；C：S组；D：I组。

图1 各组大鼠电镜心肌线粒体超微结构改变

3 讨 论

机体组织缺血性后，可以通过手术、溶栓等医学技术实现缺血组织器官重新获血液灌注，称缺血再灌注，其结果使组织器官功能得以改善，但如果组织缺血时间较长，在再灌注同时还会带来损伤加重，导致组织IRI。目前，对IRI的机制尚不完全清楚，研究表明，自由基、钙超载及钙震荡、细胞内pH和渗透压等可能是其产生机制[5]。缩短缺血时间、亚低温措施[6]及使用药物可以减轻此类损伤[7]。

本实验采用Langendorff离体心脏灌注模型，其优点是可以排除神经、内分泌等因素对研究结果产生的影响，较为客观地评价处理因素对研究结果的影响。本实验选择浓度为2.50%的七氟醚和1.50%的异氟醚是因为相当于大鼠1.0最低肺泡有效浓度(MAC)[7-8]，MAC可反映全身麻醉药物的效价强度，也是探讨麻醉作用机制的手段之一。因此，本实验将七氟醚和异氟醚的浓度均控制为1.0MAC。结果表明，七氟醚后处理和异氟醚后处理都可以改善再灌注后的心功能，减小MIS，发挥保护作用，且七氟醚后处理心肌保护作用优于异氟醚后处理。

线粒体是能量生成的重要场所，缺血再灌注时线粒体极易受到破坏，线粒体在缺血再灌注过程中起着中枢作用[9]。七氟醚和异氟醚的心肌保护机制可以通过影响线粒体ATP敏感性钾离子通道[10-11]和线粒体通透性转化孔开放发挥改善线粒体功能状态的作用[12-13]。此外，线粒体功能障碍，导致细胞色素C通过线粒体外膜释放到细胞质中，通过激活Caspase级联反应，直接启动凋亡途径，引起细胞凋亡[14]。七氟醚后处理通过抑制线粒体细胞色素C释放到细胞质，下调Caspase-8蛋白的表达，减少细胞凋亡，从而发挥心肌保护作用[15]。七氟醚和异氟醚同属卤代烃基醚[5]，七氟醚血气分配系数为0.65，异氟醚血气分配系数为1.4，在临床麻醉中，七氟醚在起效时间、作用强度、清醒时间等优于异氟醚。比较组织/血气分配系数七氟醚同样小于异氟醚[5]，本实验结果显示，七氟醚后处理和异氟醚后处理都可以减轻再灌注后线粒体损伤程度，七氟醚后处理的心肌线粒体损伤程度要小于异氟醚后处理，可能与此药理作用有关。

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Comparison of effects of post-treatment with inhalation anesthetics on rat myocardial ischemia reperfusion injury*

ZhuJiajun1,WangDaliang2,WangYongwan1,XuHailong1,LiuJindong2△

(1.DepartmentofAnesthesiology,GuanyunCountyPeople′sHospital,Lianyungang,Jiangsu222200,China; 2.DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Objective To compare the myocardial protective effects of post-treatment with sevoflurane and isoflurane on myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI) in adult rats.Methods Twenty-four adult male SD rats were divided into four groups(n=6) by using the random number table,control group(C),ischemia-reperfusion group(R),sevoflurane post-treatment(S) and isoflurane post-treatment group(I).The Langendorff isolated heart perfusion model was established.The heart rate(HR),left ventricular end-diastolic pressure(LLVEDP),left ventricular developed pressure(LVDP),maximum rate of rise of left ventricular pressure(LV+dp/dtmax),and maximum rate of decrease of left ventricular pressure(LV-dp/dtmax) were recorded at the end of equilibrium perfusion,and at 30,90 min of reperfusion,respectively.At the end of infusion,1 mm3of apical myocardial tissue was removed for observing mitochondrial structure under electron microscopy and scoring.The myocardial infarct size(MIS) in the remaining heart tissue was measured by TTC staining.Results Compared with the R group,the S and I groups showed improved cardiac function indicators,decreased MIS,and reduced mitochondrial damage after reperfusion(P<0.05).Compared with the S group,the I group showed worse heart function,increased MIS,and more severe mitochondrial damage after reperfusion(P<0.05).Conclusion Post-treatment with sevoflurane and isoflurane has a protective effect on MIRI in adult rats.Post-treatment with sevoflurane has a better cardioprotective effect than that with isoflurane.

myocardial ischemia;reperfusion injury;sevoflurane post-treatment;isoflurane post-treatment;mitochondria

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.007

2014年连云港市第五期“521工程”科研项目资助计划(62)。 作者简介：朱家军(1964-)，主任医师，硕士研究生，主要从事麻醉中重要脏器功能保护研究。△

，E-mail:liujindong1818@163.com。

R453.9

A

1671-8348(2017)18-2468-03

2017-01-22

2017-03-26)