一株副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

陈云政 青海省门源县农牧和科技局 810300

一株副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

陈云政 青海省门源县农牧和科技局 810300

副猪嗜血杆菌病（又称猪革拉泽氏病），是由巴斯德菌科嗜血杆菌属的副猪嗜血杆菌感染引起的急性败血症，以多发性纤维素性浆膜炎、脑膜炎和关节炎为主要特征。猪感染副猪嗜血杆菌后出现发热、咳嗽、呼吸困难、腹部膨大、跛行和共济失调等症状，死亡率高。近年来，随着养猪业集约化的发展，副猪嗜血杆菌病发病率呈上升趋势，可单独或混合感染，已成为严重影响养猪业的新发典型性疾病，给养猪业带来巨大的经济损失。

2016年10月,青海省门源某猪场发生了一种以纤维性浆膜炎、脑膜炎和关节炎为主要特征的传染病，该病发病急，发病猪出现体温升高、咳嗽、呼吸困难、腹部膨大等症状，个别病猪跛行、共济失调，死亡率高达20%以上。剖检可见腹腔内有黄色液体，心包积液，胸膜、腹膜有浆液性和脓性纤维蛋白渗出。脑部脑膜出血，有血性渗出，脑回展平。肺脏淤血水肿。脾脏及肠系膜淋巴结肿胀，有纤维蛋白渗出物。采集发病猪的心包液等病料经实验室进行细菌分离培养、生化鉴定、药敏试验及动物回归试验检测，确定为副猪嗜血杆菌感染。现报告如下。

1 材料与方法

（1）主要试验材料。病料为从青海省门源几个猪场采集的疑似副猪嗜血杆菌感染的病猪的心包积液及呼吸道分泌物。健康哺乳仔猪购自河南大学实验动物中心。

（2）主要试剂。HPS培养基、NAD、金黄色葡萄球菌、鸡血清等试剂购自北京索莱宝科技有限公司。药敏纸片购自北京天坛生物公司。其他化学试剂如氯仿、异丙醇、乙醇等均为国产分析纯产品。

（3）细菌的分离培养。无菌取发病猪的肺脏、腹膜、胸水和心血划线接种TSA平板，放置于37℃ 的CO2培养箱中培养48小时，观察生长情况及菌落特征。细菌涂片并进行革兰氏染色，镜检。

（4）细菌的生化鉴定。将所分离细菌接种于血平板上，金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，置于37℃ 的CO2培养箱培养36小时，观察是否有“卫星现象”，并观察是否有溶血现象。挑取具有卫星生长现象的单菌落转移接种于微量生化反应管，按照杭州天和微生物试剂有限公司说明书进行，观察生化特性鉴定结果。

（5）药敏试验。无菌条件下对分离细菌培养物利用K-B纸片扩散法进行药敏试验，将分离的副猪嗜血杆菌菌落接种在TSA培养基中，培养后沾取单菌落均匀涂布于添加NAD的鲜血琼脂平板上，用灭菌镊子夹取各种药敏纸片分别贴在适当的位置，将培养皿置于37℃下培养48小时，观察测定抑菌圈的大小，判断对不同药物的敏感性。

（6）细菌致病性动物回归试验。将纯化的分离菌增菌培养12～24小时制成细菌悬液，接种4只健康的哺乳仔猪，静脉注射0.4mL/只，观察实验仔猪的发病情况，剖检死亡仔猪观察病理变化，并取呼吸道分泌物及心包液镜检。

2 结果与分析

（1）细菌的分离培养。取病变部位组织研磨后接种于培养基37℃，培养48小时后观察菌落特征。表面光滑湿润、边缘整齐、针尖大小无色透明的小菌落，革兰染色可见革兰氏阴性细小杆菌，通常可见荚膜。

（2）细菌的生化鉴定。本实验选择分离的不具有溶血特性，但依赖NAD的菌株进行生化鉴定，生化试验结果表明，该菌糖发酵特性活泼，能发酵葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等，氧化酶试验为阴性，尿素酶、过氧化氢酶试验呈阳性，不产生吲哚。

病原菌的生化鉴定结果为葡萄糖+、乳糖-、甘露糖+、麦芽糖+、蔗糖 +、半乳糖 +、果糖 +、木糖 -、接触酶+、过氧化氢酶+、吲哚-、尿素酶-、氧化酶-、硝酸盐还原+。 “+”表示阳性/产酸不产气，“-”表示阴性/不发酵。

（3）药敏试验结果。该分离株嗜血杆菌对不同药物的敏感程度有所差异，对环丙沙星、庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星高敏，对氨苄青霉素中敏，而对林可霉素和链霉素不敏感，具有耐药性，见表1。

表1 药敏试验结果

（4）细菌致病性动物回归试验。将分离纯化的嗜血杆菌接种哺乳仔猪后，出现发热、咳嗽、呼吸困难、腹部膨大、跛行、共济失调等症状。剖检可见呼吸道有大量的分泌物，心包积液，腹膜有浆液性纤维蛋白渗出。取其呼吸道分泌物和心包积液涂片染色镜检，可见革兰氏阴性细小杆菌。

3 讨论

副猪嗜血杆菌病在我国的发病报道越来越多，并呈流行趋势。根据临床症状、典型病理变化，以及病原菌的分离鉴定可以进行诊断。本试验中分离的病原菌从培养特性、染色镜检、溶血特性及生化特性等方面都符合副猪嗜血杆菌的生物学特性。将分离菌的培养产物接种哺乳仔猪后，出现该病的典型症状，动物回归试验证实该菌具有较强的致病性。剖检症状与副猪嗜血杆菌的症状一致，证实猪群被副猪嗜血杆菌感染。