数字PCR技术在布鲁菌病疗效判定中的应用价值

郭瑛 韩冰 王丽 孙华丽 刘贵明 蒋荣猛

数字PCR技术在布鲁菌病疗效判定中的应用价值

郭瑛 韩冰 王丽 孙华丽 刘贵明 蒋荣猛

目的 探讨数字PCR技术检测血清布鲁菌含量对疗效判定的应用价值。方法 选择2015年1月至2016年5月首都医科大学附属北京地坛医院收治的15例布鲁菌病恢复期患者，即布鲁菌病急性期患者经过规范抗生素治疗6周后仍有布鲁菌病相关临床症状的患者为研究对象，用数字PCR技术检测血清布鲁菌含量，并同时做血培养和布鲁菌凝集试验，比较三种试验结果。结果 15例患者布鲁菌病恢复期患者血清凝集试验结果均为阳性，14例患者未在血清中检测出布鲁菌DNA，仅有1例患者血清布鲁菌DNA定量检测结果为阳性，并且血培养阳性。剩余14例患者血培养阴性。结论 数字PCR技术为发现和确诊布鲁菌病现症感染病例提供了快速、快捷的方法，但仍需大样本进行验证。

布鲁菌病；数字PCR技术

布鲁菌病是一种古老的人畜共患性疾病，由布鲁菌感染引起，以长期发热、肝脾大、关节疼痛和慢性化为特征的人畜共患传染病，曾被命名为波状热和地中海热。在世界范围内均有分布。据统计，全世界每年新增约50万病例[1]。我国主要流行于内蒙古自治区、吉林省、黑龙江省、新疆维吾尔自治区、西藏自治区等。布鲁菌病有多种传播途径，临床表现多样，病程可长达数月至数年。部分布鲁菌病患者在治疗过程中或治疗后，仍有自觉布鲁菌病症状，如发热、乏力、盗汗和肌肉关节痛等。此时，早期正确鉴别诊断是治疗失败、复发还是重新感染是后续治疗成功的关键。目前，布鲁菌病实验室诊断技术缺乏快速、简便的方法，仍以分离培养和血清凝集试验、补体结合试验和酶联免疫吸附试验为主要检测手段。布鲁菌分离培养是实验室诊断的金标准。临床上主要采用血培养和骨髓培养。但是培养阳性率低，要求条件高，且存在生物安全性风险，临床因实验室条件限制不能常规开展。在我国，临床常规开展的血清凝集试验主要为虎红平板凝集试验(RBT)和试管凝集试验。RBT主要检测血清中总抗体，技术简单，价格便宜，被广泛作为初筛试验使用。阳性诊断价值较低，对于没有布鲁菌暴露危险因素患者诊断价值较高，对于反复暴露和既往感染患者诊断价值有限。试管凝集试验(SAT)常被用作布鲁菌病的诊断技术，主要检测IgG、IgM和IgA。但是各国具有诊断意义的抗体滴度标准不一致，未找到合适的抗体滴度诊断标准，且慢性期敏感性较低。补体结合试验(Coombs)主要检测血清中不完全和非凝集抗体，作为SAT的补充。Coombs在慢性期和复发患者中诊断价值优于血清凝集试验，敏感性和特异性较高。但该项检测方法操作复杂、耗时，需要一定的设备，难以在临床常规开展。ELISA能够检测血清中IgM和IgG抗体。单独检测IgM抗体可为急性期患者提供可靠的诊断，但是，当患者体内存在高滴度的IgG抗体时，干扰对IgM抗体的检出。不仅如此，类风湿因子也可导致假阴性结果。PCR技术自出现以来，被广泛应用于感染性疾病的诊断。美国指南推荐PCR技术作为布鲁菌病诊断初筛试验，以IS711为引物的PCR试验被广泛应用于检测血清中布鲁菌含量，应用前景广阔。但普通PCR技术检测敏感性低，且为相对定量，结果不够精确。布鲁菌血培养技术耗时、阳性率低，且存在生物安全风险。布鲁菌血清凝集试验、补体结合试验和酶联免疫吸附试验和普通PCR技术均存在一定的局限性。本文初步探讨利用数字PCR技术检测血清布鲁菌DNA含量对布鲁菌病恢复期的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年1月至2016年5月首都医科大学附属北京地坛医院收治的15例布鲁菌病恢复期患者，即布鲁菌病急性期患者经过规范抗生素治疗6周后仍有布鲁菌病相关临床症状的患者。

1.2 入选标准

1.2.1 符合布鲁菌病急性期诊断标准：①流行病学史：发病前与家畜和畜产品、布鲁菌培养物等有密切接触史，或生活在布鲁菌病流行区的居民等。②有发热、乏力、多汗、肌肉和关节痛，或伴有肝、脾和淋巴结肿大等临床表现。③实验室分离出布鲁菌，试管凝集试验、补体结合试验或布鲁菌病抗人-球免疫球蛋白试验阳性。④病史≤6个月。

1.2.2 非急性期：符合布鲁菌病急性期诊断标准，并接受抗生素治疗6周后，仍有布鲁菌病相关临床症状的患者。

1.3 数字PCR试验方法

1.3.1 主要试剂:血液DNA提取试剂盒购自qiagen公司，QX200 ddPCR EvaGreen Supermix，微滴发生卡(DG8TM Cartridges)，微滴发生油(QX200TM Droplet Generation Oil for EvaGreen)购自伯乐公司，引物在上海生工公司合成。

1.3.2 数字PCR:引物针对IS711基因设计[2]，扩增产物长度252 bp,引物序列如下，BF:CATGCGCTATGTCTGGTTAC；BmR：AGTGTTTCGGCTCAGAATAAT。模板DNA提取按照试剂盒的说明书。布鲁菌基因组DNA由中国疾控中心布病室赠予。实验设计包括空白对照孔，阳性对照孔，阴性对照孔，样品孔。空白对照孔模板用无菌水替代，阳性对照孔模板是布鲁菌的基因组DNA，阴性对照孔模板是健康人基因组DNA，样品孔模板是15名患者血清提取的DNA。

1.3.3 配制数字PCR反应体系:Eva Green Supermix 12 μl,模板DNA 33 ng，上下游引物2 pmol，加水至24 μl。吸取20 μl转移至微滴发生卡的sample行(中间行)，油滴行加入70 μl微滴发生油，盖上胶垫后，平稳放置在微滴生成仪中，开始生产微滴。将生成微滴转移至96孔PCR板，反应条件：95℃ 变性5 min，95℃30 s，57℃ 60 s，40个循环，4℃ 5 min，90℃ 5 min，4℃保存。将反应完成的96孔板平稳放入微滴读取仪中，打开quanta soft软件，输入样品信息后，点击run。

2 结果

2.1 一般情况 15例布鲁菌病恢复期患者中，男5例，女10例;年龄21～56岁。布鲁菌乳胶凝集试验由北京地坛医院完成，本组病例均为阳性。血培养阳性1例。

2.2 流行病学史 15例患者均来自疫区或从事畜牧业相关工作。

2.3 临床表现 15例患者有明显的布鲁菌病自觉症状，主要为发热、腰痛肌肉和关节痛、乏力等。见表1。

2.4 血清布鲁菌定量检测 有自觉症状的15例布鲁菌病恢复期患者中，1例血清布鲁菌DNA定量明显升高，2.34拷贝/μl，且血培养阳性。其余患者均未检测出布鲁菌DNA。

表1 15例布鲁菌病恢复期患者的临床症状

3 讨论

布鲁菌病经过规范6～8周抗生素治疗后，95%的患者病情有不同程度的好转，进入恢复期。然而，少部分患者仍自觉有布鲁菌病相关临床症状，如发热、乏力、盗汗、腰痛和关节痛等。此时，需要对布鲁菌病恢复期患者进行正确诊断，鉴别是治疗失败、复发还是重新感染，将决定临床医生的治疗决策。目前，诊断布鲁菌病主要依靠分离培养和凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验和普通PCR技术。

布氏杆菌分离培养是诊断的金标准。临床上主要采用血培养和骨髓培养。据统计，急性期患者血培养敏感性为18.4%～90%，慢性期敏感性差，30%～70%[3-5]。骨髓培养比血培养灵敏度高，尤其是对已经应用抗生素患者[6]。培养阳性率主要取决于疾病分期、抗生素应用和培养方法等[7]。

布氏杆菌分离培养存在生物安全性问题。据不完全统计，在过去的25年中，实验室布氏杆菌感染率为18%～31%[8]。目前仅应用于科研，临床因实验室条件限制不能常规开展。

RBT主要检测血清中总抗体，技术简单，价格便宜，被广泛作为初筛试验使用。Skendros等[9]研究显示，在急性期，RBT敏感性接近100%，特异性87.5%，阴性预测值接近100%，而阳性预测值只有11.4%。然而，Arabaci等[10]对急性期患者研究发现，RBT敏感性48.1%，特异性96.1%,阳性预测值为1，阴性预测值低于0.5。由此可见，不同地区RBT急性期诊断价值存在差异。Al Dahouk等[11]认为，慢性期RBT敏感性差，约70%。总体而言，RBT对于没有布氏杆菌暴露危险因素患者诊断价值较高，对于反复暴露和既往感染患者诊断价值有限[12]。

SAT常被用作布鲁菌病的诊断技术，主要检测IgG、IgM和IgA。WHO指南推荐其为初筛试验，我国指南认定为确诊试验。但是，无论作为初筛试验，还是确诊试验，SAT均存在一定问题：(1)具有诊断学意义的抗体滴度尚未确定。WHO指南推荐SAT≥1∶160为布鲁菌病诊断标准。我国指南规定急性期诊断标准为SAT滴度≥1∶100，慢性期≥1∶50。(2)敏感性一般。据统计，SAT在急性期诊断敏感性从37.4%～90%[10,13]不等。慢性期敏感性差，为27.5%[14]。但恢复期SAT滴度较急性期升高4倍或以上，诊断价值较高[15]。

Coombs主要检测血清中不完全和非凝集抗体，作为SAT的补充。Coombs在慢性期和复发患者中诊断价值优于血清凝集试验，敏感性和特异性较高。不仅如此，Roushan等[6,10]研究认为，Coombs对于急性期诊断价值优于SAT、RBT和ELISA等。脑脊液Coombs对于合并脑膜炎患者诊断价值较大[14,16]。但该项检测方法操作复杂、耗时，需要一定的设备，难以在临床常规开展。

ELISA能够检测血清中IgM和IgG抗体。Roushan等[6,10]研究显示，单独检测IgM抗体可为急性期患者提供可靠的诊断，敏感性和特异性与SAT和Coombs相近。但是，单一检测血清中布氏杆菌抗体，可能会导致假阴性结果[16,17]。例如，当患者体内存在高滴度的IgG抗体时，干扰对IgM抗体的检出。不仅如此，类风湿因子也可导致假阴性结果，试验前应将其除去。ELISA对慢性期和复发患者的诊断价值优于SAT，与Coombs相似，但试验方法更为简单[15,18]。

当前，用编码BCSP31设计的B4/B5引物常被用于人布鲁菌病诊断。Casanova等[17,19]研究发现，诊断布鲁菌病急性期敏感性为98.3%，特异性为100%。对慢性期和复发患者也有一定诊断价值[20]。Fadeel等[18,21]报道了一个多重PCR实验(Bruce-ladder)用于从种水平上鉴定所有布氏杆菌，包括布氏杆菌的6个陆生种、海洋种和疫苗株S19、RB51、Revl。另有研究对比了分别以IS711、bcsp31、per设计的探针和引物的实时PCR，结果证明依据IS711设计引物和探针的PCR在鉴别布氏杆菌时表现最好的灵敏性、特异性、高效性和重复性[19,22]。Castano等[20,23]研究显示，在布鲁菌病流行地区，用以B4/B5为引物的传统PCR作为布鲁菌病初筛试验，以IS711为引物的实时PCR作为确证试验，不仅可用于布鲁菌病诊断，还可鉴定种型，具有广阔应用前景。

目前，我国布鲁菌病实验室诊断主要依靠RBT初筛，SAT进行确诊。但是，SAT试验作为确诊试验存在不足，表现在：(1)无论急性期还是慢性期，具有诊断价值的抗体滴度阈值尚未确定，缺乏大规模样本验证。(2)在疾病早期，由于抗体合成需要至少1周时间，SAT滴度可能<1∶160[3,4,23]。因此，对于急性期患者，一份SAT检测结果滴度<1∶160，不能除外布鲁菌病。临床高度怀疑布鲁菌病应在1～2周后复查。(3)SAT对于慢性期诊断特异性一般。32%的患者即使经过正规治疗，随访1年后，SAT滴度仍≥1∶80[12]。因此，布鲁菌诊断必须结合患者病史、临床表现和实验室检查进行综合判定。当前，开展新型实验室诊断技术迫在眉睫。

PCR技术作为病原学检测技术已经开始广泛应用于临床。第一代PCR技术通常采用电泳的方法对PCR产物进行分析，存在操作繁琐，容易出现交叉污染，只适用于定性研究等局限。为了克服传统PCR的不足，并满足生物学研究中对核酸定量分析的要求，1992年诞生了第二代PCR，即荧光定量PCR。荧光定量PCR在PCR扩增的同时对反应体系中引入的荧光信号进行实时检测分析，通过三个参数(荧光信号、-Cq值、DNA模板起始浓度)间的关系，确定靶标基因相对于外部参照(标准曲线或对照样本)的含量或表达水平。由于荧光定量PCR的结果曲线依赖-Cq值、PCR扩增效率和参照系，2009年由科学家们协商制订的定量PCR实验指南明确了定量PCR试验流程标准化和质量控制的必要性；更具意义的是指南还给出了规范定量PCR流程和质控环节的check-list，其核心目标旨在规范各实验室的数字PCR技术流程，统一试验技术思路、保证荧光定量PCR试验信息的透明度，以确保定量PCR试验结果的重复性、可靠性。然而对于-Cq值、PCR扩增效率和参照系的依赖仍是定量PCR技术的最大技术瓶颈，在这个意义上的定量也只能是相对的、间接的。而且在靶核酸分子风度低、样本间模板浓度差异细微的情况下，定量PCR的检测灵敏度和精确度都受到了限制，已不能满足临床实验室诊断的要求。

在这样的背景下，第三代PCR技术应运而生。QX200微滴式数字PCR系统属于第三代PCR技术。QX200微滴发生器可将含有核酸分子的荧光PCR反应体系分割成数万个纳升级的微滴，核酸分子在各微滴中随机分级，每个微滴或不含特检核酸靶分子，或者至少一个待检核酸靶分子，且每个微滴都是一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，QX200微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为“1”，没有荧光信号的微滴判读为“0”，从而将荧光模拟信号数字化，因此该技术被称为数字PCR。最终根据泊松分布原理及阳光微滴的比例，分析软件可直接给出待检靶分子的拷贝数浓度，上述过程中荧光信号产生原理与定量PCR相同，可以采用具有序列特异性TapMan探针，也可以采用成本更低的新型核酸嵌入式染料-EvaGreen，因此，定量PCR与数字PCR的衔接是无缝的。

全新的数字化终点检测方式和分子技术的定量手段，赋予QX200微滴式数字PCR系统卓越的性能，即无需标准曲线和参照，对影响PCR效率的抑制物不敏感，大大提高了检测灵敏度、精确度、准确度和重复性，并实现了真正意义上的绝对定量。数字PCR技术较普通PCR技术而言，敏感性更高，且能够定量，是今后早期快速检测布鲁菌的发展方向。

本研究初步探讨分析15例布鲁菌恢复期病例的临床资料和数字PCR检测血清布鲁菌DNA定量检测结果。本研究结果显示，15例患者布鲁菌血清凝集试验结果均为阳性，说明凝集试验抗体可能为既往感染后产生的IgG抗体，并不能区分现症感染和既往感染。14例患者未在血清中检测出布鲁菌DNA，仅有1例患者血清布鲁菌DNA定量检测结果为阳性，说明部分布鲁菌病恢复期患者血清中布鲁菌含量很低或不存在。因此，对于规范治疗进入恢复期仍然有自觉症状的患者，可以利用数字PCR技术检测血清布鲁菌DNA的含量，为布鲁菌病的后续治疗提供依据。同时，数字PCR检测血清布鲁菌DNA阳性患者，血培养也是阳性，表明数字PCR可以取代血培养作为恢复期是否还有布鲁菌存在的一种方法，但只是初步探讨，尚需要扩大样本量验证。对于血清布鲁菌数字PCR检测阳性的患者，考虑存在现症布鲁菌感染，临床应继续给予抗布鲁菌治疗。

临床资料显示，血清布鲁菌DNA检测阳性病例较阴性病例有明显的高热症状(体温39.5℃)，且布鲁菌血培养阳性，提示存在菌血症。14例血清布鲁菌DNA定量检测阴性患者有不同程度发热，但无高热，体温37.3～38℃，血培养阴性，提示可能不存在布鲁菌菌血症。14例患者都存在不同程度的腰痛、关节痛和睾丸肿痛等自觉布鲁菌病临床症状，分析靶器官损伤可能不是布鲁菌直接损伤所致，而是由迟发型免疫反应所致，与文献报道[9,10]相符。对于布鲁菌数字PCR检测阴性，但仍有自觉症状的患者，是否需要继续治疗，需综合患者临床表现，红细胞沉降率、C-反应蛋白、血清凝集试验结果综合考虑，评估是否需要继续治疗。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.15.013

项目来源：首都医科大学附属北京地坛医院院内科研基金(编号：DTQL201404)

010000 呼和浩特市，内蒙古医科大学附属医院药剂部(郭瑛);首都医科大学附属北京地坛医院感染性疾病诊疗与研究中心，感染病科国家临床重点专科(韩冰、孙华丽、蒋荣猛);中科院北京基因组研究所(王丽、刘贵明)

蒋荣猛，100015 首都医科大学附属北京地坛医院感染性疾病诊疗与研究中心，感染病科国家临床重点专科；

E-mail:13911900791@163.com

R 516.7

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1002-7386(2017)15-2292-04

2017-02-14)