芝麻11S蛋白制备方法及结构性质研究

李若昀，张国治，黄纪念，芦 鑫，张问夕，杨 帆

（1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001；2.河南省农科院 农副产品加工研究所，河南 郑州 450002；3.天津利金粮油股份有限公司，天津 300112）

芝麻11S蛋白制备方法及结构性质研究

李若昀1,2，张国治1*，黄纪念2，芦 鑫2，张问夕3，杨 帆2

（1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001；2.河南省农科院 农副产品加工研究所，河南 郑州 450002；3.天津利金粮油股份有限公司，天津 300112）

以脱脂亚临界芝麻饼粕为原料，考察盐析法、碱溶超滤酸沉法、碱溶盐析法、碱溶超滤盐析法制备芝麻11S蛋白的效果，并分析芝麻11S蛋白的结构性质。结果表明：碱溶超滤盐析法适宜分离提取芝麻11S蛋白，其提取率和蛋白纯度较高（分别为75.47%和83.18%），且酸碱亚基比例与原料中11S蛋白基本一致。与芝麻蛋白相比，芝麻11S蛋白的氨基酸组成存在一定差异，侧链氨基酸含量高；二级结构基本相似，但β-折叠、β-转角和β-反平行含量稍高；表面疏水性强；吸水性、乳化性、泡沫稳定性差。

芝麻11S蛋白；超滤；功能性质

0 引言

芝麻(Sesame)属胡麻科胡麻属，生长在亚热带及热带地区，一年生油籽作物，营养价值高，富含油脂和蛋白质，其中蛋白含量达到20%～25%。芝麻蛋白是一种优质的植物蛋白，具有较好的功能特性和较高的营养价值[1-2]。芝麻蛋白主要由2S、7S和11S蛋白组成，其中芝麻11S蛋白是芝麻蛋白的主体，占60%左右，因此研究芝麻11S蛋白对深入了解芝麻蛋白功能性质与加工应用有积极意义[3-4]。

目前芝麻11S蛋白常用的提取方法是盐析与层析。研究发现，30%的硫酸铵饱和度适宜芝麻11S蛋白的分离，但是盐析获得的芝麻11S蛋白纯度低；琼脂糖凝胶柱层析可以较好地分离纯化芝麻2S、7S、11S蛋白，但是该方法样品处理量小、分离时间长、后续仍需浓缩脱盐[3,5]。因此，芝麻11S蛋白的分离方法有待改进。

膜分离是利用膜的选择性分离实现料液的不同组分的分离、纯化和浓缩，能较好保持生物大分子活性。超滤是膜分离的重要分支，适宜蛋白、多糖等生物高分子的分离浓缩，已经广泛地应用于生物工程、制药、食品、水处理、化工等领域[6]。作者采用超滤结合盐析工艺制备芝麻11S蛋白，考察其产率、亚基组成、氨基酸含量，以期建立一种高效制备芝麻11S蛋白的方法；此外，初步分析其结构功能性质，以便为芝麻11S蛋白的深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

亚临界脱脂芝麻粕：各组分含量为蛋白质（32.94±0.35）%、脂肪（5.23±0.45）%、水分（4.96±0.08）%、灰分（11.64±0.28）%，由河南省农科院提供。

TRIS、丙烯酰胺、N,N’-亚甲双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠 （SDS）、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）：均为电泳纯，美国 Amresco公司。

1.2 主要仪器与设备

CTXNW-10B超声循环提取机：北京弘祥隆生物技术开发有限公司；DMJ60-3三级纳滤膜过滤系统：济南博纳生物技术有限公司；LYOVAC GT1冷冻干燥机：德国SRK系统技术有限公司；K-05型自动定氮仪：上海晟声自动化分析仪器有限公司；DYY-12型电泳仪电源、DYCZ-24DN型电泳仪：北京六一仪器厂；Gel Doc XR+凝胶成像系统：美国伯乐BIO-RAD公司；荧光光谱仪：Agilent Technologies公司；FW-4A型粉末压片机：天津市拓普仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪：Nicolet IS5赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芝麻11S蛋白的制备

1.3.1.1 盐析法提取11S蛋白(SOG)

参考Allaoua Achouri等[7]的方法，脱脂芝麻粕与1 mol/L NaCl，pH 7.5磷酸盐缓冲溶液按料液比1∶10混合，25 ℃下搅拌 2 h，5 000 r/min离心 40 min，上清液抽滤，测体积，冰浴加入硫酸铵达到30%饱和度，4℃静置过夜，4℃下12 000 r/min离心15 min，沉淀透析，冷冻干燥，得到芝麻11S蛋白粗提物。

1.3.1.2 碱溶超滤酸沉法提取11S蛋白（AUAG）

脱脂芝麻粕与蒸馏水按料液比1∶20混合，40℃，pH 至 10.5，搅拌 40 min，5 000 r/min离心 30 min，上清液采用截留分子质量25 ku膜超滤，截留液调 pH 至 4.4，过夜，5 000 r/min离心 30 min，沉淀透析，冷冻干燥，得到芝麻11S蛋白粗提物。

1.3.1.3 碱溶盐析法提取11S蛋白（ASG）

一次离心（ASG-Ⅰ）：脱脂芝麻粕与1 mol/L NaCl按料液比 1∶18混合，40 ℃，pH 10.5，搅拌 40 min，调节 pH 至 7.5，5 000 r/min离心 40 min，上清液抽滤，测体积，冰浴加入硫酸铵达到30%饱和度，4℃静置过夜，8 000 r/min离心15 min，沉淀透析，冷冻干燥，得到芝麻11S蛋白粗提物。

两次离心（ASG-Ⅱ）：脱脂芝麻粕与1 mol/L NaCl按料液比 1∶18混合，40 ℃，pH 10.5，搅拌 40 min，5 000 r/min离心 30 min，上清液调pH至7.5，再次5 000 r/min离心40 min，上清液抽滤，测体积，冰浴加入硫酸铵达到30%饱和度，4℃静置过夜，8 000 r/min离心15 min，沉淀透析，冷冻干燥，得到芝麻11S蛋白粗提物。

1.3.1.4 碱溶超滤盐析法提取11S蛋白（AUSG）

脱脂芝麻粕与1 mol/L NaCl按料液比1∶20混合，40 ℃，pH 10.5，搅拌 60 min，5 000 r/min离心30 min，上清液采用截留分子质量25 ku膜超滤，截留液调pH至7.5，5 000 r/min离心30 min，测上清液体积，冰浴加入硫酸铵达到30%饱和度，4℃静置过夜，5 000 r/min离心30 min，沉淀透析，冷冻干燥，得到芝麻11S蛋白粗提物。

1.3.2 提取蛋白成分分析

水分含量测定参照GB/T 5009.3—2010；灰分含量测定参照GB/T 5009.4—2010；粗蛋白含量测定参照GB/T 5009.5—2010；氨基酸分析参照GB 5009.124—2003。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

参考Achouri等[5]的方法，采用3%浓缩胶（pH 6.8）和 12%分离胶（pH 8.8），上样量 5 μL，电压220 V，浓缩胶电流16 mA，分离胶电流28 mA，染色1～2 h，脱色3次（每次40 min以上），最后在凝胶成像系统中进行成像处理。

1.3.4 蛋白功能特性分析

1.3.4.1 吸水性测定[8]

吸水性（g/g）=（W2-W1）/W0，

式中：W0为称取的蛋白质量（g）；W1为吸水前总质量（g）；W2为吸水后总质量（g）。

1.3.4.2 吸油性测定[9]

吸油性（g/g）=（W2-W1）/W0，

式中：W0为称取的蛋白质量（g）；W1为吸油前总质量（g）；W2为吸油后总质量（g）。

1.3.4.3 乳化性及乳化稳定性测定[10]

称取3 g蛋白样品，加50 mL蒸馏水，pH 7.0，加入50 mL大豆油，10 000 r/min均质 2 min，1 500 r/min 离心 5 min。记录乳化层高度（H0），管中液体总高度（H）。乳化性（EA）=H0/H。

将上述乳化样品置于50℃水浴加热30 min，冷却至室温。1 500 r/min离心5 min。记录乳化层高度（H1），管中液体总高度（H2）。乳化稳定性（ES）=H1/H2。

1.3.4.4 起泡性及泡沫稳定性测定[11]

称取1 g蛋白样品，加50 mL蒸馏水并调节pH至 7.0，12 000 r/min搅打2 min。记录泡沫体积（V0），总体积（V）。起泡性（FC）=V0/V。

将上述溶液室温静置30 min后，记录泡沫体积（V1）。泡沫稳定性（FS）=V1/V0。

1.3.4.5 氮溶解指数的测定

分别称取0.5 g芝麻蛋白、芝麻11S蛋白，调节pH值为3～10，30℃水浴振荡 1 h，8 000 r/min离心20 min，采用凯氏定氮法测定上清液中可溶性氮含量。

NSI（%）=（N1/N）×100，

式中：N1为可溶性氮质量（g），N为样品中总氮质量（g）。

1.3.4.6 红外光谱测定

蛋白样品与溴化钾混匀研磨压片，波长扫描范围为400～4 000 cm-1，扫描次数64，分辨率 4 cm-1，光谱数据用Origin8.5软件进行分析。

1.3.4.7 蛋白质表面疏水性测定

激发波长365 nm，发射波长484 nm，测定其荧光强度（FI）。以荧光强度对一定质量浓度梯度的蛋白质溶液（0.005～0.5 mg/mL）作图，初始段的斜率即为蛋白质表面疏水值。

2 结果与分析

2.1 各种提取方法制备芝麻11S蛋白的效率与成分分析

由表1可以看出：5种提取方法所得芝麻11S蛋白灰分含量差异性较为显著，AUSG法提取的芝麻11S蛋白含量和产率比其他方法高，可见其提取效果好；另外，单独使用盐析或截留的方法蛋白提取效果并不理想，但将两者结合起来蛋白提取结果较好；虽然ASG-II法可以提高蛋白纯度，但是蛋白提取率下降，且增加操作次数，不值得推荐。

表1 不同方法制备芝麻11S蛋白的提取率及成分分析Table 1 Extraction yield and composition analysis of sesame 11S prtein with different preparation methods%

2.2 芝麻11S蛋白的SDS-PAGE电泳分析

不同提取方法获得的芝麻11S蛋白电泳图见图1，结果分析见表2。

由表2可以看出：SOG采用硫酸铵盐析进行纯化，2S蛋白残留量较多；AUAG采用碱提后，用膜分离进行纯化，虽然除去部分小分子蛋白，但2S蛋白残留量依然较高；ASG在碱提时，体系中的氯化钠对芝麻蛋白进行了一步分离，随后采用硫酸铵进行盐析，又再次除去杂质，因此芝麻11S蛋白的比例有所上升；AUSG依次使用氯化钠、膜过滤和硫酸铵进行分离纯化，所以纯度较高，而且酸碱亚基含量比值为1.64，相对于其他4种方法最接近原料蛋白中11S蛋白的酸碱亚基含量比值（1.61），基本未改变芝麻11S蛋白组成。证明碱溶超滤盐析法最适宜于分离芝麻11S蛋白。

综合以上结果，以碱溶超滤盐析法制备11S蛋白，研究其氨基酸组成、蛋白结构与功能性质。

2.3 芝麻11S蛋白与芝麻蛋白的氨基酸组成对比分析

由表3可以看出：芝麻11S蛋白氨基酸组成与芝麻蛋白的氨基酸组成存在一定差异，其中丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、组氨酸、精氨酸含量高于芝麻蛋白。同时，由于半胱氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸含量高，芝麻11S蛋白具有较好的营养价值。

图1 不同提取方法获得的芝麻11S蛋白电泳图Fig.1 Electrophoresis figure of sesame 11S prtein with different preparation methods

表2 芝麻11S蛋白电泳结果分析Table 2 Electrophoresis results analysis of sesame 11S prtein with different preparation methods %

表3 氨基酸组成分析Table 3 Amino acid compositions analysis g/100g

2.4 芝麻11S蛋白与芝麻蛋白的功能性质对比分析

由表4可以看出：芝麻11S蛋白的各种功能性质参数与芝麻蛋白相比差异小，其中芝麻11S蛋白吸水性略有降低，这是因为芝麻11S蛋白是碱溶性蛋白，在中性条件下溶解度较低，其吸水性也由此变小，同时受蛋白质含量、流动性、疏水性、颗粒表面性质的影响，吸油性也会有所不同[12]。蛋白质的乳化性受分子的柔顺性、蛋白的溶解度等条件的影响，其中蛋白的溶解度是比较重要的影响因素，溶解度越低，相应的乳化性也就越差，同样受蛋白溶解度的影响，芝麻11S蛋白的起泡性比芝麻蛋白低，泡沫的黏度不高，泡沫间结合力小，稳定性也较差。

2.5 氮溶解指数测定结果分析

蛋白溶解性随pH变化曲线见图2。在pH 3～10范围内，芝麻蛋白和芝麻11S蛋白的溶解性变化趋势相似，均随着pH值的增大先降低后升高，在pH 4～5溶解性较低，在pH 3、pH 8～10溶解性较高，且在pH值为10时溶解度达到最大值(芝麻蛋白溶解度为84.51%，芝麻11S蛋白溶解度为96.95%)。这一变化趋势与Achouri等[5]报道的相一致，在pH 4～5达到等电点，蛋白质分子间相互作用力减弱，蛋白颗粒相互碰撞凝聚产生沉淀。在pH 3、pH 8～10环境下，蛋白质分子带有电荷，在静电力的作用下，其颗粒不易聚集，分散在溶液中，蛋白溶解性也因此提高。由图2还可看出，在pH 3～4和pH 8～10，芝麻11S蛋白的溶解性高于芝麻蛋白，究其原因可能为，芝麻蛋白中的2S蛋白为水溶性蛋白，使芝麻蛋白在一系列pH环境中保有一定的溶解性，而芝麻11S蛋白为碱溶性蛋白，只有在达到一定pH值时才能表现出较好的溶解性。

表4 芝麻蛋白功能性质分析Table 4 Functional properties analysis of sesame protein

2.6 红外光谱结果分析

图2 蛋白溶解性随pH变化曲线Fig.2 The changes curve of protein solubility with pH

芝麻蛋白与芝麻11S蛋白红外扫描图见图3。红外光谱酰胺Ⅰ带 1 600～1 700 cm-1范围是二级结构的敏感区域，是计算蛋白二级结构的主要谱带。参考He等[13]的分析方法对拟合图谱进行分析，按照 α-螺旋 （1 650-1 660 cm-1）、β-折叠（1 610-1 642 cm-1）、β-转角（1 660-1 680 cm-1）、β-反平行（1 680-1 700 cm-1）、无规卷曲（1 642-1 650 cm-1）的二级结构指认标准得到表5。

通过拟合发现，芝麻11S蛋白与芝麻蛋白二级结构组成相似，主要由β-折叠、β-转角和α-螺旋组成，这验证了芝麻蛋白主要由芝麻11S蛋白组成的事实。芝麻11S蛋白的β-折叠、β-转角和β-反平行含量高，且无规卷曲含量低，可能是造成芝麻11S蛋白在水中溶解性差的原因之一。

图3 芝麻蛋白与芝麻11S蛋白红外扫描图Fig.3 Infrared scan of sesame protein and sesame 11S prtein

图4 蛋白表面疏水性测定结果Fig.4 Detection of surface hydrophobicity of protein

表5 蛋白质二级结构组成分析Table 5 Protein secondary structure analysis %

2.7 表面疏水性结果分析

蛋白表面疏水性测定结果见图4。在pH 7时，芝麻11S蛋白的表面疏水性为1 228.1，芝麻蛋白的表面疏水性为920.9，芝麻11S蛋白的表面疏水性大于芝麻蛋白。根据Kato等[14]的研究，蛋白质的表面疏水性与α-螺旋结构呈负相关，当蛋白质分子内α-螺旋结构含量降低时，暴露出的分子内部隐藏的疏水位点增多，蛋白质分子表现出的表面疏水性更强，这与芝麻11S蛋白α-螺旋结构含量降低而表面疏水性增强的变化趋势是一致的。

3 结论

通过对5种不同分离提取芝麻11S蛋白的方法进行对比分析发现，碱溶超滤盐析法的蛋白提取率和蛋白纯度高 (分别达到75.47%和83.18%)，同时其酸碱亚基比例更接近天然蛋白，因此碱溶超滤盐析法是适宜的芝麻11S蛋白制备方法。对芝麻11S蛋白进行结构和功能性质分析发现，芝麻11S蛋白与芝麻蛋白的氨基酸组成存在差异，其侧链氨基酸残基含量高；芝麻11S蛋白二级结构基本与芝麻蛋白相似，主要由β-折叠、β-转角和β-反平行等有序结构组成；11S蛋白吸水性、乳化性、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性与芝麻蛋白相比有所降低，吸油性有所升高，氮溶解指数在碱性条件下高于芝麻蛋白。本文虽然对芝麻11S蛋白的分离提取方法和蛋白结构功能及性质进行了探究，但芝麻11S蛋白结构与功能性质的关系、芝麻11S蛋白的生物活性及酶解特性尚未涉及，仍需开展后续研究。

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THE PREPARATION AND STRUCTURE PROPERTY OF SESAME 11S PROTEIN

LI Ruoyun1,2， ZHANG Guozhi1， HUANG Jinian2， LU Xin2， ZHANG Wenxi3， YANG Fan2
（1.School of Food Science and Technology， Henan University of Technology， Zhengzhou 450001， China ；2.Institute of Agricultural Products Processing， Henan Academy of Agricultural Science， Zhengzhou 450002，China；3.Tianjin Lijin Grain and Oil Co.，Ltd.，Tianjin 300112，China)

Sesame protein is a kind of high quality plant protein，which has good functional properties and nutritional value.Sesame protein is mainly composed of 2S，7S and 11S protein，while sesame 11S protein is the main component of sesame protein accounting for 60%.In the present study，defatted sesame cake deriving from subcritical extraction was used as raw material，the performance of preparation of sesame 11S protein by salting out，combination of alkali extraction and salting out，combination of alkali extraction，ultra-filtration and acid precipitation and combination of alkali extraction，ultra-filtration and salting out was investigated，and the structure and property of sesame 11S protein were also analyzed.Results showed that the method of combination of alkali extraction，ultra-filtration and salting-out was most suitable for sesame 11S protein preparation and the yield and purity of products were higher than other methods，which were 75.47%and 83.18%，respectively.The afforded 11S protein had the same acid subunits to alkali subunits ratio with the raw material.Sesame 11S protein showed some difference on the amino acid compositions with sesame protein，especially the amino acid content on the side-chain of 11S protein was higher than sesame protein.There was no significant difference in secondary structure between sesame protein and sesame 11S protein ，but the contents of β-sheet，β-turn，β-antiparallel in sesame 11S protein were slightly higher.Furthermore，sesame 11S protein exhibited the stronger surface hydrophobicity than sesame protein，while its water holding capacity，emulsifying capacity，foam stability were weaker than those of sesame protein.

sesame 11S protein；ultra-filtration；functional properties

TS229

B

1673-2383(2017)03-0006-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170621.1050.004.html

网络出版时间：2017-6-21 10:50:18

2016-09-06

河南省农业科学院优秀青年基金项目

李若昀（1992—），女，山西高平人，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。

*通信作者