赤拟谷盗对4种小麦挥发物的触角电位及行为反应

董 震，汪中明，张洪清，张 涛，伍 祎，江亚杰，章 妺，林丽莎，曹 阳*

（1．河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001；2．国家粮食局科学研究院，北京 100037；3．福建省粮油科学技术研究所，福建 福州 350001）

赤拟谷盗对4种小麦挥发物的触角电位及行为反应

董 震1，汪中明2，张洪清2，张 涛2，伍 祎2，江亚杰1，章 妺2，林丽莎3，曹 阳2*

（1．河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001；2．国家粮食局科学研究院，北京 100037；3．福建省粮油科学技术研究所，福建 福州 350001）

拟通过触角电位技术（EAG）技术探索利用化学信息物质监测防治赤拟谷盗的方法。探索了赤拟谷盗EAG测量过程中的基本操作方法，揭示了其离体触角EAG反应的适应性和持续时间；利用EAG技术和四臂嗅觉仪检测了赤拟谷盗对4种不同浓度小麦挥发物的触角电位及行为反应。结果表明：EAG测量过程中两次刺激的最小间隔为60 s；30 min内EAG值变化幅度约为5%；在一定浓度范围内，赤拟谷盗对4种小麦挥发物的EAG反应随挥发物浓度的增加而增强，但水杨酸甲酯质量浓度超过5 μg/μL后赤拟谷盗EAG值开始下降；行为反应测试中，苯甲醛表现出对赤拟谷盗有一定的引诱作用。EAG结果与行为反应有一定的相关性，但也存在区别。因此，要确定气味物质对昆虫的活性，还需要到实际环境中进行试验。

赤拟谷盗；小麦挥发物；EAG；行为反应

0 前言

赤拟谷盗（Tribolium castaneum Herbst）属鞘翅目拟步甲科，是一种重要的世界储粮害虫，为害严重[1]。目前，赤拟谷盗防治仍然以PH3熏蒸为主[2]，对赤拟谷盗危害的监测与综合防治，应开展全方位的研究[3]。探索赤拟谷盗和化学信息物质之间的相互作用关系是寻求防治方法的重要工作[4-5]。植物释放的挥发性气味与昆虫的定位、取食、繁衍等生活行为息息相关[6-9]，触角电位技术（EAG）是鉴别植物挥发性物质对昆虫有无作用的常用技术之一，通过触角电位的有无和大小，可以判断刺激物对昆虫是否有活性和活性强弱，快速准确地筛选出活性物质[10-12]。

农业上应用EAG技术已发现了许多活性物质，如测定小菜蛾时，六碳醛、青叶醇等能引起小菜蛾较高的触角电位反应，在行为上也表现出对小菜蛾的吸引[13]。鞘翅目昆虫对萜烯类物质的触角电位反应较强烈，如松褐天牛雄虫对Carene的反应最为强烈[14]。此外，测量不同组合、配比及剂量的人工合成性信息素对棉铃虫雄虫的触角电位反应，对进一步改进棉铃虫性诱剂的田间应用具有指导意义[15]。

赤拟谷盗由于其触角微小（不到1 mm）且虫体坚硬，限制了触角电位技术在其中的应用。作者拟探索赤拟谷盗EAG测量过程中的基本操作方法及条件，揭示其离体触角EAG反应的适应性和持续时间，为赤拟谷盗EAG的测量提供参考；利用EAG技术和四臂嗅觉仪检测赤拟谷盗对4种不同浓度小麦挥发物的触角电位及行为反应，对比分析触角电位与行为反应的关系，为进一步揭示赤拟谷盗的嗅觉反应特点、探索信息物质在赤拟谷盗监测和综合防治中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

赤拟谷盗试虫由国家粮食局科学研究院提供，人工气候室内连续多代饲养，温度（25±1）℃，光照黑暗比为16∶8。选择生长发育一致、羽化后34 d的健康成虫进行触角电位和行为测试。

1.2 仪器与设备

常规用具：移液枪、移液枪头、小镊子、毛笔、Kaisaling液、巴斯德管、玻璃毛细管、滤纸等。

触角电位仪[16]：荷兰Syntech公司，主要由5部分组成，即IDAC-4型四通道信号采集控制器、EAG数据记录及分析软件、PRG-2型探头及电极固定器、CS-55型刺激气流控制器、MP-22型显微操作台；防电磁干扰的法拉第笼：自制；QP-01型四臂嗅觉仪：点将（上海）科技股份有限公司。

1.3 标准化合物

选取4种小麦挥发物组分[17]：6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO），98%，Merck；顺-3-己烯乙酸酯（HA），99%，沃凯；苯甲醛（BD），98%，AR（沪试）；水杨酸甲酯（MS），99%，Sigma。正己烷：98%，AR（京试）。

1.4 触角电位反应测试

1.4.1 测试方法

首先将 20 μL挥发物溶液滴加在 20 mm×5 mm的滤纸片上，然后将滤纸嵌入巴斯德管中，密闭后置于冰箱中待用。操作过程中，将巴斯德管接气流控制器，出口正对触角并始终保持与触角相同距离，由气流控制器提供气流，流量100 mL/s，刺激时间为0.4 s，由记录仪记录数据[18]。测试过程中，首先利用改造过的移液枪头将参比电极插入赤拟谷盗头部，玻璃电极内充满Kaisaling液，此时头部及触角离体；然后将触角端部套在记录电极中，触角与记录电极内的Kaisaling液接触，同时应保证触角完全暴露在空气中，尤其是末端膨大的3节，以保证触角所有部位均可接受刺激物的刺激。测试时环境温度保持在28℃。1.4.2 触角EAG适应性测定

“无规矩不可成方圆”。党中央的“八项规定”“三严三实”及“自律准则”“处分条例”等就是最好的规矩。千里之堤毁于蚁穴，一些巨贪，往往就是从贪小便宜步步为“盈”“炼”成的。“易鱼”类似事件的严肃处理，体现的是“抓早抓小”，防微杜渐，以遏制由量变到质变。“好规矩”需善始善终，严要求产生好成效，严管理养成好习惯，严标准才能得民心。杜绝“易鱼”类似案例发生，打虎学武松拳头要硬的同时，拍蝇力度亦不能松。

为了确定每两次刺激的最佳间隔时间，用20 μL的苯甲醛作为标准刺激物，间隔时间分别为15、30、60 s，每次处理共刺激5次，重复3根触角。每种间隔刺激的EAG反应结果用第一次的测定结果标准化[18]，即标准化的×100%。

1.4.3 触角持续反应时间测定

为了明确赤拟谷盗触角接受刺激的持续反应时间，用20 μL的苯甲醛作为标准刺激物，每间隔15 min刺激1次，共刺激8次，重复3根触角。以第1次刺激获得的EAG反应值标准化。比较2 h内EAG反应的变化[18]。

1.4.4 剂量反应

为了明确赤拟谷盗触角对不同浓度刺激物的剂量反应，对苯甲醛（BD）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）、水杨酸甲酯（MS）和顺-3-己烯乙酸酯（HA）做剂量反应。挥发物质量浓度分别为0.005、0.05、0.5、5、50 μg/μL。

1.5 行为反应测试

测定时调节气流速度为370 mL/min,在此速度下四臂嗅觉仪的4个区域分界明显[19]。四臂嗅觉仪进气口连接带有活性炭的圆底烧瓶，以得到纯净的空气。选择对角的两个区作为处理区，剩下的两个区域为对照区，以触角电位反应中反应值最高的浓度作为每种反应物的测试浓度，在气味源瓶内加入20 μL该浓度待测信息气味物质。每种浓度样品测试3次，每次测试30头成虫。测试5 min后，检查各诱集瓶内（或联结管的进口孔）的测试昆虫数量，计算诱集率。

2 结果与分析

2.1 触角EAG适应性测定

赤拟谷盗离体触角在15、30、60 s时间间隔下的EAG反应如图1所示。从图1可以看出，在15 s和30 s时间间隔下，其EAG反应值在第2次重复刺激时显著下降，EAG值下降分别约为40%和20%，赤拟谷盗表现出了对苯甲醛的反应适应性。当时间间隔为60 s时，连续刺激5次的EAG反应值变化很小。因此，选定两次刺激的最小时间间隔为60 s。

图1 赤拟谷盗在3种时间间隔下的EAG反应Fig.1 Nomalized EAG response values of T.castaneum to BD at 3 different time intervals

2.2 触角持续反应时间测定

利用赤拟谷盗离体触角测定EAG，其EAG反应值在120 min内的变化如图 2所示。总体上看，120 min内，EAG总体下降了约 50%。前30 min EAG值变化幅度较小，下降幅度约5%；30～60 min之间，EAG值下降幅度较大；60 min后，EAG值下降幅度较小，但 EAG值维持在较低水平。因此，每个赤拟谷盗离体触角的联系测量时间不应超过30 min，以保证获得准确的测量值。

图2 赤拟谷盗在120 min内的EAG反应Fig.2 Nomalized EAG response values of T.castaneum within 120 min

2.3 剂量反应

赤拟谷盗对4种刺激物的剂量反应曲线如图3所示。整体上看，在一定范围内，赤拟谷盗对4种刺激物的EAG值随4种刺激物质量浓度的增大而增大。当刺激物质量浓度较小时，赤拟谷盗对4种刺激物的EAG值比较接近，随着质量浓度的增大，赤拟谷盗对不同种类的刺激物的EAG反应值出现了较大差别，随苯甲醛（BD）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）、和顺-3-己烯乙酸酯（HA）质量浓度的升高，EAG始终保持上升的趋势；而当水杨酸甲酯质量浓度大于5 μg/μL时，EGA开始下降。

图3 赤拟谷盗的剂量反应曲线Fig.3 EAG dose-dependent curve for T.castaneum

2.4 行为反应测试

利用四臂嗅觉仪测试赤拟谷盗对4种气味物质的行为反应，结果如表1所示。从表1可算出苯甲醛的诱集率为63.33%，t检验结果表明苯甲醛的诱集率显著高于对照（P＜0.01）；其余3种气味物质与对照组无显著性差异。

表1 赤拟谷盗对4种气味物质的行为反应Table 1 Behavioral response of T.castaneum to 4 volatiles

3 讨论与结论

赤拟谷盗触角与电极的连接是EAG测量的关键，触角与电极的连接质量将直接影响测试信号的稳定性和获得数据的可靠性。赤拟谷盗触角较小，只有约1 mm，连接难度大，每次连接应采取相同的操作方法以保证基本相同的连接质量。刚连接好的触角，获得的信号可能不稳定，此时应待信号稳定后，方可进行测量。

在测量过程中，当赤拟谷盗触角末端膨大的三节浸入记录电极内的Kaisaling液时，很难获得反应信号。因此，赤拟谷盗触角末端不应插入Kaisaling液内，但应保证触角与Kaisaling液的接触，使得触角获得刺激物的充分刺激；同时我们猜测，赤拟谷盗触角末端膨大的三节可能聚集了大量的味觉感受器。在以后的测试工作中，还可以用Kaisaling液浸没赤拟谷盗触角末端不同的小节，以分析末端不同的小节对物质的感受作用。

温度对信号的测量也有影响。室内温度低于25℃时，有时将无法获得测试信号，室温28℃更有利于测试的进行。未来还应进行不同温度下的测量研究，以获得最佳的测试环境温度。

已有的研究表明，昆虫对某些化学信息物质的触角电位反应与行为反应一致，而对另外一些化学信息物质的则不相关甚至负相关[20]。本试验中赤拟谷盗对4种气味物质都表现出了EAG反应，但只有苯甲醛对赤拟谷盗有显著的引诱效果。因此，要确定气味物质对昆虫的活性，还需要到实际环境中进行试验，因为实际环境中存在的气味物质更为复杂，这可能对所测试的信息物质产生干扰[21]。不过，EAG数据至少可以表明赤拟谷盗可以检测到哪些化学物质，这有助于明确赤拟谷盗的嗅觉反应特点，更有针对性地发掘对赤拟谷盗有生物活性的信息物质。

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Abstract：The method of using semiochemicals to monitor and control Tribolium castaneum (Herbst)was investigated by testing its vitro antenna.Meanwhile，the basic operation methods and environmental conditions in the process of the EAG test and the adaptability and duration of EAG response of vitro antennas were also investigated.EAG and behavioral responses of T.castaneum to 4 wheat volatiles and their relationship were tested and analyzed.The results showed that the minimum interval between the two stimuli was 60 s in the EAG test;the change of EAG value within 30 min is about 5%.In a certain concentration range，the EAG and behavioral response values of T.castaneum to 4 volatiles increased with the increase of the concentration of volatiles，but significantly decreased to more than 5 μg/μL of methyl salicylate.In behavior tests，benzaldehyde exhibited certain attraction effects to the insects.There existed certain correlation and difference between the EAG and behavioral response values of T.castaneum to 4 volatiles.Therefore，the bioactivity of volatiles on the insects still need to be further determined in practical environment.

ELECTROANTENNOGRAM(EAG)AND BEHAVIORAL RESPONSES OF TRIBOLIUM CASTANEUM(HERBST)TO 4 WHEAT VOLATILES

DONG Zhen1，WANG Zhongming2，ZHANG Hongqing2，ZHANG Tao2，WU Yi2，JIANG Yajie1，ZHANG Mo2，LIN Lisha3，CAO Yang2
（1.School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；2.Academy of State Administration of Grain， Beijing 100037，China；3.Fujian Research Institute of Cereal and Oil Science and Technology，Fuzhou 350025，China）

Tribolium castaneum(Herbst)；wheat volatiles；EAG；behavioral response

TS210

B

1673-2383(2017)03-0056-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170621.1050.020.html

网络出版时间：2017-6-21 10:50:46

2016-10-07

国家国际科技合作项目（2013DFA31960）；国家粮食公益专项（201513002-01）

董震（1989—），男，河南新乡人，硕士研究生，研究方向为农业昆虫与害虫防治。

*通信作者