BP神经网络结合响应面优化罗布麻总黄酮的提取工艺

王慧竹，陈盟杰，石琳，朱文静，杨鑫

（1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022；2.吉林大学药学院，吉林长春130021）

BP神经网络结合响应面优化罗布麻总黄酮的提取工艺

王慧竹1，2，陈盟杰1，石琳1，朱文静1，杨鑫1

（1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022；2.吉林大学药学院，吉林长春130021）

为研究酶法辅助超声波提取罗布麻总黄酮的提取工艺，以总黄酮提取率为评价指标，考察酶用量、酶解pH值、酶解温度、超声时间对罗布麻总黄酮提取率的影响，在单因素试验基础上，利用响应面法优化总黄酮提取工艺，以响应面试验数据作为BP神经网络的输入值，对主要影响因素进行仿真优化。结果显示，罗布麻总黄酮的最佳提取工艺条件为：酶用量0.11 g/g、酶解pH5.1、酶解温度67℃、超声时间33 min。在此工艺条件下，罗布麻总黄酮提取率为32.26%。

BP神经网络；响应面法；罗布麻；总黄酮

罗布麻（Apocynum venetumL.）属于夹竹桃科多年生宿根性草本植物，又名红麻、茶叶花、红柳子，在我国辽宁、吉林、内蒙古、甘肃、山东等地均有分布。《中国药典》记载其“性甘、苦、凉，归肝经，具有平肝安神，清热利水的功效。主要用于肝阳眩晕、心悸失眠、浮肿尿少”[1]。现代药理研究表明，黄酮类化合物是罗布麻最主要的活性成分[2]，具有调节血压、降血脂、保肝、抗抑郁、抗氧化、镇静等功效[3-7]，目前从罗布麻中提取黄酮类化合物的方法主要有煎煮法[8]、热回流提取法[9]、索式提取法[10]、微波辅助提取法[11]、超声提取法[12]、闪式提取法[13]等。在提取工艺的研究过程中必定要涉及到优化问题，目前较常用的有正交设计、因子设计、均匀设计、中心复合设计等。

人工神经网络是近年来研究和应用都十分活跃的一种信息处理工具，主要是在对人脑组织结构和运行机制的认识理解基础上，模拟其结构和智能行为的一种工程系统。BP神经网络（back propagation neural network）是人工神经网络中基于误差反向传播算法的多层前馈神经网络，利用BP网络能从试验数据中自动获取数学模型，它无须事先给出公式的形式，而是以试验数据为基础，经过训练后获得一个反映试验数据内在规律的数学模型，训练好的神经网络能直接进行推理，此外神经网络在处理规律不明显、变量多的问题时具有优越性[18]。

本研究采用响应面试验与BP人工神经网络相结合，优化酶法辅助超声波提取罗布麻总黄酮的工艺条件。以期为进一步开发罗布麻总黄酮资源提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗布麻：吉林市吉林大药房；芦丁对照品（纯度＞98%）：成都曼斯特生物科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；亚硝酸钠（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；硝酸铝（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；纤维素酶（酶活力＞40 000 U/g）：宁夏夏盛实业集团有限公司。

1.2 仪器与设备

TU-1950双光束紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵：河南巩义市英峪仪器厂；RE-3000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SK2510HP超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；FA2204B电子天平：上海精科天美科学仪器有限公司；RT-08多功能粉碎机：荣聪精密科技有限公司.

1.3 方法

1.3.1 芦丁对照品溶液的制备

精密称取10.0mg芦丁对照品，以体积分数为50%的乙醇溶液溶解并定容至50mL，摇匀，获得质量浓度为0.20mg/mL的芦丁对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备

称取罗布麻叶3.0g，按料液比1∶10（g∶mL）加入体积分数为50%的乙醇溶液30 mL，调节溶液pH值为5.5，加入0.1 g/g纤维素酶，60℃水浴酶解120 min，然后设超声功率200 W，超声提取2次，每次40 min，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，定容至50 mL，即得供试品溶液。

1.3.3 芦丁标准曲线的绘制

精密量取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL的芦丁对照品溶液，置于10mL的容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min后，再加入10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min，最后加入4%氢氧化钠溶液4 mL，并用体积分数为50%的乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，静置15 min。以空白试剂为对照，于波长504 nm处测定吸光度值A。以质量浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度值A为纵坐标绘制芦丁标准曲线，获得芦丁标准曲线回归方程为A=13.03C+0.053 3，相关系数为0.999 8。

1.3.4 总黄酮的提取率的测定

精确吸取1.3.2中供试品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用体积分数为50%的乙醇溶液定容。按1.3.3方法测定其吸光度值，根据芦丁标准曲线回归方程计算供试品溶液中总黄酮的质量浓度，罗布麻中总黄酮提取率计算公式如下：

式中：W为总黄酮提取率，%；C为根据吸光度值计算出的溶液质量浓度，μg/mL；D为溶液稀释倍数；V为供试品溶液体积，mL；m为药材取样量，g。

1.3.5 单因素试验

以酶用量（按每克药材用量计）、酶解pH、酶解温度、超声时间为主要影响因素进行单因素试验，考察酶用量（0.06 g/g、0.08 g/g、0.10 g/g、0.12 g/g、0.15 g/g）、酶解pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、酶解温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、超声时间（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）对罗布麻总黄酮提取率的影响。

1.3.6 响应面试验

通过单因素试验，选取酶用量（A）、酶解pH（B）、酶解温度（C）、超声时间（D）为影响因素，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以罗布麻总黄酮提取率（Y）为评价指标，设计4因素3水平响应面分析[14]，以-1、0、1编码分别代表自变量低、中、高水平，响应面试验因素与水平见表1。

表1 罗布麻总黄酮提取工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for total flavonoids extraction process optimization ofA.venetum

1.3.7 数据处理

单因素试验结果和响应面试验结果采用SAS 9.4软件进行统计分析，图表采用Origin 8.5软件进行绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶用量对总黄酮提取率的影响

图1 酶用量对罗布麻总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of enzyme addition on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

由图1可知，总黄酮的提取率随着酶用量的增大而增加。当酶用量从0.06 g/g增至0.10 g/g时，总黄酮提取迅速增加；继续增加酶用量。总黄酮提取率增加变化不明显。因此，选择酶用量为0.08 g/g、0.10 g/g、0.12 g/g进行响应面试验。

2.1.2 酶解pH对总黄酮提取率的影响

由图2可知，罗布麻总黄酮提取率随pH的升高而增加，当酶解pH 5.0时总黄酮提取率达到最大，为31.5%；当酶解pH＞5.0时，总黄酮提取率随pH的升高而下降。因此，选择酶解pH为5.0、5.5、6.0进行响应面试验。

图2 酶解pH对罗布麻总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of enzymolysis pH on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

2.1.3 酶解温度对总黄酮提取率的影响

图3 酶解温度对罗布麻总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

由图3可知，随酶解温度的增加，总黄酮提取率呈先增加后减少的趋势，当酶解温度从40℃升高至60℃时，总黄酮提取率逐渐增加，并到达最大值，为31.1%；继续增加酶解温度，罗布麻总黄酮提取率开始下降，因此，选择酶解温度为50℃、60℃、70℃进行响应面试验。

2.1.4 超声时间对总黄酮提取率的影响

图4 超声时间对罗布麻总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids fromA.venetum

由图4可知，罗布麻总黄酮提取率随超声时间的延长而增加，当超声时间在20～30 min范围内时，总黄酮提取率随着时间的延长不断增大，超声时间＞30 min后，提取率基本上保持不变。因此，选择超声时间为30min、40min、50min进行响应面试验。

2.2 响应面试验结果及数据分析

2.2.1 响应面试验设计方案及结果

在单因素试验结果的基础上，选取酶用量（A）、酶解pH（B）、酶解温度（C）、超声时间（D）为自变量，以罗布麻总黄酮提取率（Y）为评价指标，进行响应面试验，其试验结果与分析见表2，方差分析结果见表3。

表2 罗布麻叶总黄酮提取工艺优化响应面试验结果与分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments for total flavonoids extraction process optimization ofA.venetum

利用SAS 9.4软件对表2数据进行回归分析，得到以总黄酮提取率（Y）为响应值的罗布麻叶总黄酮提取工艺参数多元二次回归方程：

Y=-291.758+1310.375A+69.075B+1.159C+1.3393D-5129.167A2-61AB+4.2875AC-4.475AD-4.981667B2-0.1295BC+0.0025BD-0.005 904C2-0.002CD-0.009 867D2

由表3可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P=0.216 4＞0.05），说明回归方程拟合度良好，失拟因素对方程干扰较小。方程的决定系数R为0.932 5，说明响应值的变化有93.25%来源于所选变量，一次项A、C对结果影响极显著（P＜0.01），说明酶用量、酶解温度对罗布麻总黄酮提取率均具有极显著影响；而交互项AC、AD对结果影响极显著（P＜0.01）；交互项AB显著水平（P＜0.05）；二次方项A2、B2和D2对结果影响极其显著（P＜0.01），而二次方项C2对结果影响影响呈显著水平（P＜0.05）。表明试验得到的回归方程有效性和实用性良好，可用于分析酶法辅助超声波提取罗布麻总黄酮工艺结果。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 响应面分析与优化

为了更加直观地表达各因素交互作用对罗布麻总黄酮提取率的影响，可以固定其中两个因素的值为零水平对应的值，考虑另两个因素对总黄酮提取率的影响，根据回归方程绘制响应曲面图和等高线图，结果如图5所示。由图5可知，曲面越陡峭，表明该因素对总黄酮提取率的影响越显著，响应值也越大；从等高线可以看出总黄酮提取率的最佳条件应该在圆心处[15-17]。酶用量与酶解温度的交互作用、酶用量与超声时间的交互作用、酶用量与酶解pH的交互作用对罗布麻总黄酮的提取率影响比较显著，而这与表3的分析结果正相吻合。

利用SAS9.4软件RSREG语句对模型进行典型性分析，得到罗布麻总黄酮提取的最佳工艺为：酶用量0.112g/g，酶解pH值5.28，酶解温度64.95℃，超声时间35.50 min，在此工艺条件下，罗布麻叶总黄酮提取率的理论预测值为31.34%，考虑到实际操作情况，将最佳工艺条件修正为酶用量为0.11 g/g，酶解pH值5.3，酶解温度65℃，超声时间36 min，在此工艺条件下，经过5次重复性验证试验，获得罗布麻总黄酮提取率为31.10%。

2.3 BP神经网络试验结果分析

在酶法辅助超声波提取罗布麻总黄酮提取率的响应面分析基础上，进行神经网络训练及仿真，采用27组试验数据进行训练，其中输入层为4，分别是酶用量、酶解pH、酶解温度及超声时间。隐藏层的数目训练次数等对结果有显著影响（P＜0.05），经过多次建模，最终确定隐藏层数目为35层。建立人工神经网络，网络训练次数为10 000，精度为0.01，训练函数为‘trainscg’。当网络训练至2099步时达到训练精度的要求（即0.01），将网络仿真值与响应面试验结果实测值进行比较[19]，结果见表4。

图5 酶用量、酶解pH、酶解温度和超声时间交互作用对总黄酮提取率影响的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effect of interaction between enzyme addition,enzymolysis pH,enzymolysis temperature and ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids

表4 网络仿真值与实测值的模拟误差Table 4 Simulation error of network simulation value and practical measured value

由表4可知，运用训练后的网络对主要因素进行仿真与优化，得出神经网络的最佳提取工艺为：酶用量0.114 g/g、酶解pH5.15、酶解温度67℃、超声时间33 min，在此条件下，总黄酮提取率预测值为32.12%。结合实际操作情况，将最佳工艺条件修正为酶用量0.11 g/g、酶解pH5.1、酶解温度67℃、超声时间33 min，在此条件下，总黄酮提取率实测值为32.26%。

BP神经网络模型预测值与实测值的相对误差（0.44%）较响应面优化的相对误差（0.77%）小，且BP神经网络优化的工艺条件所提取的黄酮提取率更高，说明该BP神经网络模型可以更好地预测不同工艺参数下罗布麻叶中总黄酮的提取率。

3 结论

本研究采用酶法辅助超声波提取罗布麻总黄酮，在单因素试验基础上通过响应面试验设计优化提取工艺，再以响应面试验数据为基础经过建立BP神经网络模型，并对所建的模型进行训练和仿真预测检验样本。结果表明，罗布麻总黄酮提取的最佳工艺条件为：酶用量0.11g/g、酶解pH5.1、酶解温度67℃、超声时间为33min。在此工艺条件下，罗布麻总黄酮提取率预测值为32.12%，实测值为32.26%，网络预测值和实测值的相对误差为0.44%＜1.0%，表明建立的BP神经网络模型预测性能良好，可对罗布麻总黄酮提取结果进行预测。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部（2015版）[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2]郑永红，韦晓瑜，龙继红.罗布麻叶中黄酮类成分研究进展[J].今日药学，2010，20（8）：5-7.

[3]张素琼，燕虹，李青山.罗布麻叶有效部位降血脂及抗动脉粥样硬化的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2007，5（9）：831-832.

[4]XIONG Q,FAN W,YOKOZAW T,et al.Hepatoprotective effect of Apocynum venetumand its active constituents[J].Planta Med,2000, 66(2):127-133.

[5]BUTTERWECK V,NISHIBE S,SASAKI T,et al.Antidepressant effects ofApocynum venetumleaves in a forced swimming test[J].Biol Pharm Bull,2001,24(7):848-851.

[6]SANDEI N,MICHIKO M,CHISAKO C,et al.Flavonid content inApocynumandPoacynumleaves and lipid-peroxidation-inhibiting effect of flavonoids[J].Nat Med,1994,48(4):322-323.

[7]曾斌芳，田莉，燕雪花.新疆罗布麻的药理作用和现代应用研究进展[J].中国民族民间医药，2009，26（2）：11-13.

[8]盛萍，王新铃，杨学斌.罗布麻总黄酮提取工艺的优选[J].时珍国医国药，2006，17（4）：587-588.

[9]杨志芳，王维娜，杨坤，等.正交设计优选罗布麻叶中总黄酮提取工艺[J].中草药，2006，37（8）：1177-1178.

[10]周丽，王效山，黄和平，等.不同产地罗布麻叶总黄酮的含量测定[J].现代中药研究与实践，2005，19（5）：37-38.

[11]王慧竹，张闯，刘超.正交试验法优化罗布麻总黄酮微波提取工艺[J].吉林化工学院学报，2013，30（9）：23-25.

[12]耿岩玲，李福伟，王晓，等.罗布麻中黄酮的超声波强化提取及高速逆流色谱分离纯化[J].食品科学，2007，28（12）：47-48.

[13]白明，李连珍，王亚宁，等.正交试验法优化罗布麻叶中总黄酮的闪式提取工艺[J].安徽农业科学，2013，41（18）：7761-7762，7767.

[14]陈帅，王慧竹，薛健飞，等.响应面法优化超声提取野葛茎中葛根素的工艺[J].广东农业科学，2015，42（4）：60-66.

[15]JEAN B J,MARION A,CARLOS V G,et al.Response surface methodology to optimise accelerated solvent extraction of steviol glycosides fromStevia rebaudianaBertoni leaves[J].Food Chem,2015,166(1): 561-567.

[16]陈帅，王慧竹，朱琳，等.微波辅助双水相提取千斤拔总黄酮的工艺研究[J].河南工业大学学报，2015，36（6）：83-89.

[17]张玲，李继昌，许薇，等.响应曲面优化紫花地丁总黄酮提取工艺研究[J].东北农业大学学报，2013，44（6）：1-6.

[18]赵丽丽，陈宁，熊明勇，等.利用神经网络对L-缬氨酸发酵建模[J].无锡轻工业大学学报，2003，22（2）：44-47.

[19]蒋益虹，沈益明.人工神经网络用于红区杨梅果酒生产工艺的优化[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2003，29（3）：275-279.

Optimization of extraction process of total flavonoids fromApocynum venetumby BP neural network and response surface methodology

WANG Huizhu1,2,CHEN Mengjie1,SHI Lin1,ZHU Wenjing1,YANG Xin1
（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022,China; 2.Pharmaceutical School，Jilin University，Changchun 130021,China）

In order to study the extraction process of total flavonoids fromApocynum venetumby enzymatic assisted ultrasonic extraction,using the total flavonoid extraction rate as evaluation indexes,the effects of enzyme addition,enzymolysis pH,enzymolysis temperature and ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids fromA.venetumwas investigated.On the basis of single factor experiments,extraction process conditions of total flavonoid were optimized by response surface methodology(RSM).With RSM data as input value of BP neural network,the main influence factors were simulated and optimized.The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids fromA.venetumwere enzyme 0.11 g/g,enzymolysis pH 5.1,enzymolysis temperature 67℃and ultrasonic time 33 min.Under the conditions,the extraction rate of total flavonoids fromA.ventrumwas 32.26%.

BP neural network;response surface methodology;Apocynum venetum;total flavonoids

R931.6

0254-5071（2017）06-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.031

2017-02-25

吉林化工学院科学技术研究项目（吉化院合字[2013]第44号）；吉林市科技创新计划项目（20161215）

王慧竹（1981-），女，讲师，博士研究生，研究方向为体内药物分析。