苍术酮对急性肺损伤小鼠血清细胞因子和TLR7信号通路的影响*

陈天阳薛建华侯天禄平键胡毅翔成扬△陈建杰

（1.上海市浦东新区传染病医院，上海201299；2.上海中医药大学附属曙光医院，上海201203；3.浙江省医学科学院，浙江省实验动物与安全性研究重点实验室，浙江杭州310013）

·研究报告·

苍术酮对急性肺损伤小鼠血清细胞因子和TLR7信号通路的影响*

陈天阳1，2薛建华1侯天禄2平键2胡毅翔3成扬1，2△陈建杰1，2

（1.上海市浦东新区传染病医院，上海201299；2.上海中医药大学附属曙光医院，上海201203；3.浙江省医学科学院，浙江省实验动物与安全性研究重点实验室，浙江杭州310013）

目的观察苍术酮对急性肺损伤（ALI）小鼠血清细胞因子和TRL7信号通路的影响。方法通过呼吸道感染甲型流感病毒，诱导小鼠ALI模型。将144只雄性SPF级ICR小鼠，随机分为正常组24只，模型组120只。模型组在乙醚麻醉下通过鼻内接种IAV诱导感染，这种病毒在小鼠中引起肺炎，然后随机平均分为5组，每组24只，分别为模型对照组，利巴韦林治疗组，苍术酮低剂量、中剂量和高剂量治疗组。在造模2 h后，阳性药物组给予利巴韦林50 mg/kg灌胃给药，苍术酮高、中、低剂量治疗组分别给予苍术酮40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg灌胃给药，每日1次，连续5 d。5 d后处死动物，采集血清以及肺组织样本。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中IFN-β、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平；PCR法测定小鼠肺组织中TLR-7、MyD88、TRAF6、IFN-β mRNA表达水平；Western blot法检测NF-κB p65蛋白表达水平。结果与正常组比较，模型组小鼠血清中IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著升高（P＜0.01）。与模型对照组比较，利巴韦林组和苍术酮组IL-6、TNF-α、IL-1β炎症因子水平均显著下降，而IFN-β水平显著升高（P＜0.01），苍术酮高、低剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型对照组相比，苍术酮治疗组TLR7及其下游基因MyD88，TRAF6和IFN-β的mRNA表达显著上调（P＜0.01）。此外，Western印迹分析结果显示，模型对照组的核因子κB（NF-κB）p65蛋白表达水平与正常组相比显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，利巴韦林及苍术酮各剂量组的蛋白表达显着减少（P＜0.01）。结论苍术酮能够明显减轻ALI小鼠的肺部炎症，其作用机制依赖于TLR7信号通路的激活，诱导I型干扰素的产生和对NF-κB p65表达的抑制。

苍术酮急性肺损伤细胞因子TRL7

急性肺损伤（ALI）是机体在经历严重创伤、感染等打击后全身炎症反应综合征在肺部的表现，可进一步发展为呼吸衰竭。其病情凶险，临床治疗困难，并且死亡率较高［1］。ALI是流感病毒感染哺乳动物的主要症状之一，但是其确切的发病机制还不是很清楚［2］。苍术酮是从苍术中提取和分离出来的。相关研究表明，苍术酮具有抗流感病毒的作用［3］。本研究以甲型流感病毒感染小鼠，复制小鼠ALI模型，并观察苍术酮对ALI小鼠血清细胞因子和TLR7信号通路的影响，探讨其作用机制，为进一步开发安全有效的新药提供基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物与药物雄性SPF级ICR小鼠，体质量（22.00± 2.00）g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（浙）2014-0001。中药苍术购自华东药业公司，由浙江中医药大学鉴定。标本（编号y20141022）存放在浙江医学院药学系。苍术酮的分离与提取：采用HA121的超临界液体萃取仪（华安仪器厂）进行超临界二氧化碳萃取。取苍术饮片100 g粉碎成粉末，置于萃取釜内，在350 bar压力、温度50℃动态提取时间持续60 min，乙醇（99.9％）作为改性剂，流速为5 mL/min。超临界二氧化碳流速设定为15g/min，静态萃取时间设定为30 min。去除溶剂，得到的产物为5.8％。用于体外研究的超临界二氧化碳萃取物溶于磷酸盐缓冲液，浓度为1 mg/mL。将超临界CO2萃取物（50 g）用于硅胶柱，使用石油醚（沸点60～90℃）和乙酸乙酯（30∶1→1∶1，V/V）进行分离。首先制备色谱柱：称取硅胶40 g，将硅胶与洗脱剂按比例混合（20∶1），搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，不能留有气泡，然后加入石油醚将附着在管壁的硅胶洗下，使色谱柱面平整，平衡1 h后加入供试品进行洗脱。将萃取物溶于石油醚中，沿着色谱柱管壁缓慢加入，当液面下降至与柱表面相平时，即从色谱柱顶端缓慢加入洗脱剂石油醚。将洗脱剂石油醚沿管壁缓慢加入，打开底阀，缓慢滴加，控制流速为l mL/min，当流过色谱柱的一个空体积后即用标号的试剂瓶开始收集，得到化合物4（6 mg）、化合物3（2 mg）、化合物5（50 mg）、化合物6（4 mg）、化合物1（10 mg）和化合物2（13 mg）。采用紫外光谱、质谱分析、1H和13C核磁共振光谱鉴定，上述化合物分别为苍术内酯Ⅰ（10 mg）、苍术内酯Ⅲ（13 mg）、苍术醇（2 mg）、α-姜黄烯（6 mg）、苍术酮（50 mg）、苍术呋喃烃（4 mg），得到苍术酮，低温（-18℃）、避光保存，备用。

1.2 试剂与仪器流感A/PR/8/34病毒（H1N1亚型）和A/深圳/203/2001（H3N2亚型）由浙江省疾病预防控制中心（中国浙江省）保存。血清IFN-β白细介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）酶联免疫吸附检测试剂盒购自Biovol技术公司。Trizol裂解和提取试剂盒购自上海Biotechnology公司。cDNA合成试剂盒购自大连Takara公司。BCA试剂盒购自碧云天生物公司。NF-κB p65抗体和βactin抗体购自康成生物。Odyssey IRDye 680 conjugated山羊抗兔IgG、Odyssey Blocking Buffer均产自美国Li-Cor公司。Nonidet P40产于美国SIGMAALDRICH公司，PMSF购自美国Fluka公司。完全性蛋白酶抑制剂混合物为德国Roche公司产品；40％ Acrylamide/bis Solution［N，N’-Methylenbis-acrylamid，Mix，Ratio 37.5∶1（2.6％C）］和Tween-20购自美国Bio-Rad公司。预染蛋白标准品产于加拿大Fermentas公司。硝酸纤维薄膜、甘氨酸、Tris、TEMED、EDTA、SDS为美国Amresco产品。异丙醇、溴酚蓝购自上海试剂三厂。过硫酸铵、甲醇、浓盐酸均为分析纯，购自中国国药集团化学试剂有限公司。Odyssey红外扫描系统为Li-Cor公司产品。

1.3 造模与给药将144只雄性SPF级ICR小鼠随机分为正常组24只，模型组120只。模型组在乙醚麻醉下通过鼻内接种IAV诱导感染，这种病毒在小鼠中引起肺炎，然后随机平均分为5组，每组24只，分别为模型组，利巴韦林组，苍术酮低、中、高剂量治疗组。在造模2 h后，苍术酮治疗组分别给予低、中、高剂量为10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg，利巴韦林组给予50 mg/kg采用灌胃给药，每日1次，共5 d。模型组以及正常组小鼠，在相同的时间间隔给予0.9％氯化钠注射液。

1.4 采集与检测1）血清炎症细胞因子检测。经过5 d的治疗，测定动物体质量后处死动物。采集血标本，离心3000×g共20 min分离血清，储存于4℃待检。血清IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。2）肺组织TLR7信号通路蛋白的测定。小鼠肺组织采用Trizol试剂进行匀浆和提取总RNA（Biotechnology Co.Ltd.）。根据试剂盒提供的操作说明，合成cDNA（Takara公司）。本研究使用的特异性引物（TLR-7、MyD88、TRAF6、IFN-β和18sRNA）见表1，由上海生工公司合成。选择真核细胞的18S rRNA作为研究对象的看家基因。扩增反应体系含有2 μL cDNA、0.5 μL正向和反向引物（终浓度每0.5μM）、12.5 μL 2×SYBR Green，无核酸酶的水，反应体积为25 μL。扩增反应的条件为：95℃1 min，然后40个循环，95℃变性10 s，55℃退火25 s，64℃延长25 s，然后64℃延长25 s采集荧光数据。使用2-ΔCt×106方法计算基因的相对表达水平［4］。3）Western blot检测［5-6］。采用RIPA试剂分离肺组织总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶中蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，加Odyssey blocking buffer封闭，加入1抗（NF-κB p65，工作浓度1∶1000），4℃下摇床振荡过夜，洗涤后加入2抗反应。洗涤后将膜置于Odyssey仪器上扫描、分析，使用内参照β-actin校正目标蛋白表达量。

表1 RFQ-PCR检测引物序列

1.5 统计学处理应用SPSS11.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多样本均数间比较使用ANOVA分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血清细胞因子水平比较见表2。与正常组比较，模型组小鼠血清中IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著升高（P＜0.01）。与模型对照组比较，利巴韦林组和苍术酮各组IL-6、TNF-α、IL-1β炎症因子水平均显著下降，而IFN-β水平显著升高（P＜0.01）。苍术酮高、低剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组小鼠血清细胞因子水平比较（pg/mL，±s）

表2 各组小鼠血清细胞因子水平比较（pg/mL，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

组别n正常组24模型对照组24利巴韦林组24 IFN-βIL-6TNF-αIL-1β 22.9±2.7513.6±1.21**8.64±1.09**9.15±0.38**24.5±2.5229.8±2.6618.9±1.3721.3±2.06 23.3±2.7918.5±5.99**13.4±1.54**21.6±3.36苍术酮高剂量组2430.8±3.31**12.8±1.16**9.20±0.77**13.4±0.74**苍术酮中剂量组2429.4±3.27*17.4±1.11**11.8±1.94**16.5±1.17**苍术酮低剂量组2425.8±2.8719.5±2.76**16.2±2.27*17.2±1.35**

2.2 各组小鼠肺组织TLR7信号通路蛋白的表达水平见表3，表4，图1。与模型组相比，苍术酮各组TLR7及其下游基因MyD88，TRAF6和IFN-β的mRNA表达显著上调（P＜0.01），这表明上述途径被激活。此外，Western印迹分析结果显示，模型组的核因子κB（NF-κB）p65蛋白表达水平较正常组显著增加（P＜0.01）；

表3 各组小鼠肺组织中TRL7、MyD88、TRAF6和IFN-β mRNA表达水平比较（±s）

表3 各组小鼠肺组织中TRL7、MyD88、TRAF6和IFN-β mRNA表达水平比较（±s）

组别n正常组24模型对照组24利巴韦林组24 TLR7表达量MyD88表达量TRAF6表达量IFN-β表达量1.00±0.02**1.00±0.001.00±0.01**1.00±0.01**1.49±0.221.01±0.202.01±0.141.72±0.19 1.61±0.50*0.96±0.281.93±0.241.55±0.25苍术酮高剂量组244.18±0.99**2.02±0.52**2.63±0.49**3.49±0.51**苍术酮中剂量组243.89±0.74**1.88±0.49**2.37±0.38**3.01±0.50**苍术酮低剂量组242.61±0.50**1.79±0.45**2.18±0.30*2.19±0.43**

表4 各组小鼠NF-κB p65蛋白表达水平比较（±s）

表4 各组小鼠NF-κB p65蛋白表达水平比较（±s）

苍术酮对急性肺损伤小鼠组织TLR7信号通路的调节作用（表3）。RFQ-PCR检测TLR7、MyD88、TRAF6和IFN-β mRNA表达水平（图4，图1）。Western bolt检测NF-κB p65（依次为正常对照组、模型对照组、利巴韦林组、苍术酮低、中、高治疗组），检测值采用内参照（18S rRNA或者β-actin）进行校正。

图1苍术酮对急性肺损伤小鼠肺组织TLR7信号通路的调节作用与模型组相比，利巴韦林组及苍术酮各治疗组的蛋白表达显著减少（P＜0.01）。

3 讨论

ALI是机体释放出大量炎症介质的同时，还能释放出大量的抗炎症介质，如果炎症介质和抗炎症介质失调，就会导致机体内环境失去稳定，造成机体器官损害［7］。本研究发现，苍术酮显著增加IFN-β的水平，而降低其他促炎性细胞因子的水平（IL-6、TNF-α和IL-1β）。基因检测结果发现TLR7及其下游MyD88、TRAF6和IFN-β基因表达显著上调，这表明上述信号途径被激活。Western blot分析结果显示，苍术酮治疗后，TLR7下游因子中最重要的炎症蛋白NF-κB p65蛋白表达明显减少。

TNF-α、IL-6、IL-1β是ALI早期的炎症因子，可加剧炎症细胞的浸润和黏附，并刺激巨噬细胞释放更多的促炎因子［8-10］。干扰素具有抗流感病毒的作用，正常情况下，机体干扰素水平较低，当有病毒入侵后启动干扰素调控基因的表达，生成多种蛋白质和酶作用于病毒，起到抗病毒作用［11-12］。本研究结果表明，在正常小鼠感染病毒后，干扰素-β水平呈现上升趋势，在苍术酮干预后，其血清水平明显升高，说明苍术酮抗病毒作用与提高IFN-β水平有关。Toll受体家族是一类介导细胞固有免疫的细胞膜受体家族，可以识别多种病原体，并通过不同的信号通路启动固有免疫反应，病毒入侵后可促进免疫基因的表达，在抗病毒免疫反应、致病机制、疫苗和药物研究中有非常重要的意义［13］。TLR7作为Toll受体家族的成员之一，在机体许多组织中广泛表达，在抵御病原体入侵过程中发挥重要作用［14］。TLR7的信息转导与MyD88依赖性和非MyD88依赖性都有关，2条途径均可促进干扰素的活化和释放。MyD88分子是TLR7信号转导中的接头分子，活化后的MyD88可促进肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TRAF-6）的活化，TRAF-6在细胞内与下游分子相互作用，最终引起NF-κB的活化来诱导细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表达，参与免疫与炎症反应［12，15-17］。在本研究中，笔者发现在甲型流感病毒诱导的小鼠ALI中NF-κB广泛表达。应用苍术酮干预后，NF-κB的表达明显减少。由此可推断苍术酮对ALI的治疗作用可能是通过增强TLR7、MyD88、TRAF-6和IFN-β mRNA的表达，抑制核因子NF-κB p65蛋白表达，进而减轻肺部炎症反应。

综上所述，苍术酮能够明显减轻ALI小鼠的肺部炎症，其作用依赖于TLR7信号通路的激活，诱导I型干扰素的产生和对NF-κB p65表达的抑制，可用于制备治疗的有效药物，具有良好的应用前景和应用价值。

［1］Sadowitz B，Roy S，Gatto LA，et al.Lung injury induced by sepsis：lessons learned from large animal models and future directions for treatment［J］.Expert Review of Anticancer Therapy，2011，9（12）：1169-1178.

［2］魏东，刘英，贾宁，等.H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的变化和作用［J］.中国实验动物学报，2013，21（2）：72-74.

［3］石书江，秦臻，孔松芝，等.苍术抗流感病毒有效成分的筛选［J］.时珍国医国药，2012，23（3）：565-566.

［4］Cheng Y，Mai JY，Wang MF，et al.Antifibrotic effect of total flavonoids of Astmgali Radix on dimethylnitrosamine-induced liver cirrhosis in rats［J］.Chin J Integr Med，2017，23（1）：48-54.

［5］Cheng Y，Mai J，Hou T，et al.MicroRNA-421 induces hepatic mitochondrial dysfunction in non-alcoholic fatty liver disease mice by inhibiting sirtuin 3［J］.Biochemical&Biophysical Research Communications，2016，474（1）：57-63.

［6］Cheng Y，Hou T，Ping J，et al.Quantitative succinylome analysis in the liver of non-alcoholic fatty liver disease rat model［J］.Proteome science，2016，14（1）：1-11.

［7］关岚，涂家红，李天水，等.白细胞介素在急性肺损伤大鼠中的作用［J］.中国急救复苏与灾害医学杂志，2008，3（12）：728-730.

［8］潘永利.黄芩苷对急性肺损伤大鼠的保护作用［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（3）：238-240.

［9］肖燕，崔社怀，沈渝菊，等.急性肺损伤发病过程中IL-6与肺表面活性蛋白SP-A、SP-B的关系研究［J］.军事医学，2008，32（3）：261-263.

［10］Dou W，Zhang J，Sun A，et al．Protective effect of naringenin against experimental colitis via suppression of Toll-like receptor 4/NF-κB signalling［J］．Br J Nutr，2013，110（4）：599-608．

［11］Diebold SS，Kaisho T，Hemmi H，et al.Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of singlestranded RNA［J］.Science，2004，303（5663）：1529-1531.

［12］刘蓉，苟玲，于柳，等.桂枝挥发油与桂皮醛对病毒性肺炎小鼠死亡保护作用及TLR/IFN信号机制研究［J］.中药药理与临床，2013，29（4）：33-36.

［13］杨永峰，申焕君，姜泓，等.Toll样受体4介导的抗病毒固有免疫研究进展［J］.细胞与分子免疫学杂志，2016，32（6）：854-858.

［14］王晓月，赵鹏翔，马雪梅.Toll样受体7的研究进展［J］.细胞与分子免疫学杂志，2016，32（9）：1267-1271.

［15］罗兵，李涛，徐元宏.Toll样受体的信号转导及抗感染免疫研究进展［J］.免疫学杂志，2011，27（2）：165-169.

［16］李影，陈镜宇，张玲玲，等.肿瘤坏死因子受体相关因子参与炎症免疫调节的研究进展［J］.中国药理学通报，2015，31（9）：1206-1211.

［17］张艰，李圣青，李焕章，等.NF-κB在大鼠急性肺损伤模型肺组织中的表达及N-乙酰半胱氨酸的影响［J］.细胞与分子免疫学杂志，2004，20（6）：712-715.

Effect of Atractylon on Serum Cytokines and TLR7 Signaling Pathway in Mice with Acute Lung Injury

CHEN Tianyang，XUE Jianhua，HOU Tianlu，et al.Infectious Disease Hospital of Pudong，Shanghai 201299，China.

Objective：To observe the effect of atractylon on serum cytokines and TRL7 signaling pathway in mice with acute lung injury.Methods：The acute lung injury model of mice was induced by infecting influenza A virus in the respiratory tract.A total of 144 male SPF grade ICR mice were randomly divided into the normal control group（n=24）and the model group（n=120）.In the model group，IAV was induced by intranasal administration under ether anesthesia.This virus caused pneumonia in mice，and then the mice were randomly divided into 5 groups，24 rats in each：the control group，the ribavirin treatment group，atractylon low dose，middle dose and high dose treatment groups.The positive drug group was treated with 50 mg/kg of ribavirin，and the atractylon of low，medium and high dose treatment groups were given 10 mg/kg，20 mg/kg，40 mg/kg intragastric administration，once per day，for 5 days.After 5 days，the animals were killed and the serum and lung tissue samples were collected.The levels of IFN-β，IL-6，TNF-α and IL-1β in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression of TLR-7，MyD88，TRAF6 and IFN-β mRNA in lung tissue of mice was determined by PCR.The expression of NF-κB p65 protein was detected by Western blot.Results：Compared withthe normal group，the levels of IFN-β，IL-6，TNF-α and IL-1β in the serum of the model group were significantly increased（P＜0.01）.Compared with the model group，the level of IL-6，TNF-α and IL-1βin the ribavirin group and the atractylon group decreased significantly，while IFN-β level increased significantly（P＜0.01）.There was significant difference between high and low dose groups（P＜0.05）.Compared with model control group，the mRNA expression of TLR7 and its downstream genes MyD88，TRAF6 and IFN-β were significantly up-regulated（P＜0.01）.In addition，Western blot analysis showed that the expression level of NF-κB p65 protein in model control group was significantly higher than that in normal control group（P＜0.01）.Compared with model group，the protein expression of the group was significantly decreased（P＜0.01）.Conclusion：Atractylon can significantly relieve lung inflammation in mice with acute lung injury.The mechanism depends on the activation of TLR7 signaling pathway，the production of type I interferon and the inhibition of NF-κB p65 expression.

Atractylon；Acute lung injury；Cytokines；TRL7

R285.5

A

1004-745X（2017）06-0952-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.06.004

2016-12-18）

上海市中医药三年行动计划项目（ZY3-JSFC-1-1011）；上海市浦东新区卫生系统领先人才项目（PWRL2016-01）；上海市中医药领军人才学术共同体项目（ZY3-RCPY-1-1001）；上海市浦东新区卫生系统优秀青年医学人才培养计划（PWRq2016-01）

△通信作者（电子邮箱：drchengyang@126.com）