参附注射液预处理改善大鼠急性脑梗死后氧化应激的实验研究*

陈 静 冷 静

（重庆市中医院，重庆 400021）

·研究报告·

参附注射液预处理改善大鼠急性脑梗死后氧化应激的实验研究*

陈 静 冷 静△

（重庆市中医院，重庆 400021）

目的 观察不同剂量参附注射液抑制氧化应激的作用，探求不同剂量参附注射液改善大鼠脑梗死后氧化应激的潜在机制。方法 选取70只雄性Wistar大鼠，随机分为空白组、假手术组、模型组和参附注射液组（高、中、低剂量）。除空白组外，模型组和参附注射液组采用线栓法制作大鼠脑梗死模型，假手术组仅进行手术不造模。最终选取手术和造模成功的大鼠入组，每组10只。采用伊文思蓝法检测血脑屏障通透性，给予不同剂量参附注射液干预，测定大鼠血清中总超氧化物歧化酶（SOD）、铜锌-超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性，血液过氧化氢（H2O2）水平差异，并与空白组比较。结果 模型组组伊文思蓝含量明显高于空白组和假手术组，同时模型组血清中SOD、CuZn-SOD和H2O2表达升高（P＜0.01）。不同剂量参附注射液干预组伊文思蓝均较模型组下降（P＜0.01），SOD、CuZn-SOD和H2O2表达下降（P＜0.01），尤其以高剂量参附注射液干预组更明显。结论 参附注射液减少急性脑梗死后氧化应激反应，可能通过降低血脑屏障通透性，保护神经细胞、恢复神经功能发挥作用，并呈剂量依赖。

参附注射液 脑梗死 氧化应激 血脑屏障

脑梗死后神经细胞因缺血导致缺氧，神经细胞几分钟内发生不可逆性损伤甚至死亡。死亡的大脑细胞无法再生，造成永久性的后果。脑梗死后，机体的神经细胞出现代谢失常，破坏血脑屏障，导致大脑的血脑屏障通透性增加，从而引起脑水肿的形成。现代研究表明，血脑屏障的破坏可导致脑组织缺血缺氧，增加大脑组织的损伤。临床治疗及基础研究显示，参附注射液对此类损伤具有良好的治疗和康复作用，能够减少神经细胞在此类疾病中的损伤，增加其缺氧耐受能力［1-4］。本实验通过使用参附注射液预处理大鼠，进而观察干预后大鼠急性脑梗死模型的改变以及通过药物抑制急性脑梗死后血脑屏障通透性的改变、多种氧化应激指标的表达，从而探讨参附注射液改善脑梗死后脑功能的机制，为临床应用参附注射液早期预防脑卒中提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取雄性SD大鼠70只，SPF级 ［由重庆市中药研究院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK（渝）2012-0006，动物合格证号：0001507］。实验环境符合国家大鼠屏障系统（SPF级）使用设施标准。动物饲养于空调室内，室温（22±2）℃，相对湿度（60± 5）%，饲喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食。

1.2 药物与试剂 参附注射液（购于雅安三九药业有限公司，国药准字Z51020664，产品批号11120913），黄嘌呤氧化酶法测定血清、脑组织超氧化物歧化酶（SOD）及铜锌-超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性试剂盒、比色法测定血清过氧化氢（H2O2）含量试剂盒、大鼠细胞因子白介素-6（IL-6）ELISA检测试剂盒，以上试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 造模及分组 按随机数字表法将70只Wistar大鼠分为空白组、模型组、假手术组、参附注射液高剂量组［40 mg/（kg·d）］、参附注射液中剂量组［20 mg/（kg·d）］、参附注射液低剂量组［10 mg/（kg·d）］6组，各10只，另外10只大鼠为造模和手术损失进行补充，最终手术和造模成功动物入组。所有药物经灌饲法喂给，共预处理4周。模型组大鼠给予同体积比的0.9%氯化钠溶液。采用大脑中动脉线栓法制作局灶性脑缺血模型，将大鼠用体积分数2%水合氯醛麻醉后，切开大鼠的颈中部皮肤，分离颈总动脉，然后再分离出颈内动脉及颈外动脉，结扎颈外动脉，用尼龙鱼线从颈总动脉远端切口插入颈内动脉20 mm，阻塞大脑中动脉近端血流。假手术组仅进行相同部位切开手术，不进行造模处理。

1.4 观察指标 参考相关文献［2-3］进行神经功能缺损评分，实验动物均为1～3分。伊文思蓝测定大鼠通透性变化，在脑梗死24 h后大鼠尾部静脉注射体积分数2%伊文思蓝。0.5 h后麻醉大鼠，用肝素生理盐水灌流心脏，直至右心房有清澈液体后断头，取出脑组织后浸入甲酰胺置于60℃水浴箱中孵育1 d，用分光光度计检测波长为600 nm，制定伊文思蓝标准曲线，分析脑组织中伊文思蓝含量。脑组织内IL-6含量的测定，留取大脑标本，-80℃保存。冰浴快速匀浆提取蛋白质，-20℃保存。以改良的Lowry法测定蛋白。

1.5 统计学处理 应用SAS6.12统计软件分析。计量资料以（±s）表示。各观察指标的组间比较，在满足方差齐性和正态分布时，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑缺血24 h后伊文思蓝含量比较 空白组，模型组，假手术组，参附注射液高、中、低剂量组大鼠脑缺血24 h后伊文思蓝含量分别为（1.0±0.21）μg/g、（6.5±1.94）μg/g、（1.1±0.29）μg/g、（2.1±0.37）μg/g、（2.9±0.35）μg/g、（3.4±0.47）μg/g。模型组大鼠脑缺血24 h后伊文思蓝含量明显高于空白组和假手术组，参附注射液高、中、低剂量组与模型组比较则明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 各组大鼠脑组织IL-6含量的比较 见表1。模型组与空白组相比，梗死区及非梗死区IL-6含量均升高（P＜0.01），尤其以非梗死区升高更明显；与模型组相比，参附注射液高、中、低剂量组梗死区IL-6含量无明显下降（P＞0.05），非梗死区IL-6含量均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组大鼠脑组织IL-6含量比较（pg/mL，±s）

表1 各组大鼠脑组织IL-6含量比较（pg/mL，±s）

与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别 n 梗死区IL-6含量非梗死区IL-6含量空白组 10 — 96.00±25.34模型组 10 105.00±27.26*204.00±48.56**假手术组 10 — 103.45±24.16参附注射液高剂量组 10 109.00±24.45 158.00±34.23△△参附注射液中剂量组 10 114.00±23.73 173.00±29.13△参附注射液低剂量组 10 119.00±26.33 188.00±24.27△

2.3 各组大鼠血清和脑组织SOD、CuZn-SOD活性及血清H2O2含量比较 见表2。脑梗死后，模型组大鼠各指标与空白组比较明显改变（P＜0.01）。与模型组相比，参附注射液组各剂量组SOD、CuZn-SOD活性显著升高，脑内H2O2含量显著降低。显示经参附注射液预处理，可显著改善由脑梗死所引发的氧化应激反应（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组大鼠血清和脑组织SOD、CuZn-SOD活性及血清H2O2含量比较（±s）

表2 各组大鼠血清和脑组织SOD、CuZn-SOD活性及血清H2O2含量比较（±s）

组别 n 血清SOD（U/mL）空白组 10 348.00±39.67模型组 10 207.00±22.29**假手术组 10 339.00±32.77参附注射液高剂量组 10 306.00±93.36△△参附注射液中剂量组 10 297.00±21.44△参附注射液低剂量组 10 278.00±33.69△CuZn-SOD（U/mL）血清H2O2（mmol/L）236.00±55.34 86.00±20.17 154.00±58.19**157.00±55.20**231.00±46.25 84.00±19.36 200.00±39.17△△96.00±15.27△△186.00±34.11△106.00±26.37△171.00±39.49△119.00±26.31△

3 讨 论

随着中国人口的老龄化进程的加深，脑梗死疾患发病率正逐渐增高，此病是致残、致死的主要病因之一，导致患者不同程度地丧失劳动能力以及生活自理能力，给国家、社会、家庭带来沉重的负担。因此，医学界一直在寻找有效的防治方法，以期对其进行早期干预处理。近年来的研究发现，参附注射液除具有降脂的作用之外，还具有抗炎、抗血栓、稳定斑块、延缓动脉粥样硬化的进程等作用，对心脑血管起到多方面的保护作用［2-3］。

急性脑梗死后交感神经系统过度激活致AngⅡ水平升高，脑梗死后细胞坏死等异常应激也导致IL-6等细胞因子分泌增多。IL-6也可介导炎症及免疫反应，在斑块破裂而引起的急性脑梗死这一环节中起了关键的作用［5-6］。本实验发现，参附注射液药物神经组织和细胞的保护作用可能通过降低IL-6等细胞因子实现。同时它也通过抑制异常的炎症反应，促进血管内皮细胞的修复，降低血管的通透性，维持血脑屏障正常生理功能发挥对脑组织结构和功能的保护作用。

参附注射液具有抗炎、改善内皮功能、抑制纤维蛋白的产生和血栓形成，对于脑梗死具有重要的保护作用。有研究表明该药物能够改善内皮功能，增加NO的释放，提高心肌内皮型NOS（e-NOS）的活性，这些功能可能延缓或阻止动脉粥样硬化的进程［7］。有学者报道，参附注射液类药物可以阻断包括下调RhoA的细胞内信号途径，抑制血管紧张素Ⅱ介导的交感异常应激［8-9］。同时研究发现参附注射液类药物也可能抑制不稳定斑块的炎症反应、稳定血脑屏障等。也有研究证实不同剂量参附注射液可以改善脑梗死大鼠的血脑屏障［10-15］。本实验与上述研究结果一致。

综上所述，不同剂量参附注射液干预可降低脑梗死后脑组织非梗死区IL-6的表达水平，抑制脑梗死后血脑屏障通透性的异常增高，改善脑水肿，增加SOD、CuZn-SOD水平，减少H2O2，通过抗氧化的作用，从而改善脑梗死患者的预后。本研究为在脑梗死的疾病早期使用大剂量的参附注射液，以干预病情的进展，减少其急慢性并发症，改善脑梗死患者的预后等方面提供了实验依据，可供临床作为参考，然其深入机制尚需进一步研究探讨。

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Experimental Study of Simvastatin Preconditioning on Oxidative Stress in Rats with Acute Cerebral In-farction

CHEN Jing，LENG Jing. Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chongqing 400021，China.

Objective：To observe the effect of different doses of Simvastatin on the inhibition of oxidative stress，and to explore the potential mechanism of different doses of Simvastatin in improving the oxidative stress in rats with cerebral infarction.Methods：70 male Wistar rats were randomly divided into the blank group，the sham operation group，the model group and the simvastatin groups（high，medium and low dose）.In the model group and simvastatin groups，the cerebral infarction model was made with suture method；the sham operation group was only operated without modeling.Finally，the rats with successful operation or modeling were selected into the groups，10 rats in each group.Evans blue method was used to detect blood-brain barrier permeability；given different doses of simvastatin intervention，total superoxide dismutase（SOD）in rat serum was determined，as well as copper and zinc-superoxide dismutase（CuZn-SOD）activity，and blood hydrogen peroxide（H2O2）differences，and all of the data was compared with that of the blank group.Results：The content of Evans blue in the model group was significantly higher than that in the blank group and the sham operation group.Besides，SOD，CuZn-SOD and H2O2expression in serum increased in the model group（P＜0.01）.Evans blue in different doses of simvastatin intervention groups declined，compared with that in the model group（P＜0.01）；SOD，CuZn-SOD and H2O2expression decreased（P＜0.01），especially in high dose group.Conclusion：Simvastatin can decrease the expression of oxidative stress in patients with acute cerebral infarction，which may be one of the mechanisms to reduce the blood-brain barrier permeability，protect the nerve cells and restore the function of the nervous system，and has a certain correlation with the dose.

Simvastatin injection；Cerebral infarction；Oxidative stress；Blood-brain barrier

文献标志码： 文章编号：1004-745X（2017）05-0761-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.003

2017-02-23）

重庆市社会事业与民生保障科技创新专项（cstc2016shms-zd0015）

△通信作者（电子邮箱：54408193@qq.com）