下调S100A6基因对裸鼠肺腺癌移植瘤生长和凋亡的影响

南岩东 姜华 房延凤 金发光 杨拴盈



·论著·

下调S100A6基因对裸鼠肺腺癌移植瘤生长和凋亡的影响

南岩东1姜华1房延凤1金发光1杨拴盈2

目的探讨下调靶向基因S100A6对在体肺腺癌移植瘤生长和凋亡的影响。方法18只健康Balb/c雄性裸鼠随机分为空载体对照组、阴性对照组及S100A6 基因RNA干扰组三组，每组6只动物；分别应用不携带目的基因的空载质粒、未转染任何质粒以及含有S100A6基因RNA干扰慢病毒质粒的A549肺腺癌细胞接种于裸鼠皮下，构建移植瘤动物模型；观察不同组移植瘤组织生长情况；采用Real-Time PCR、免疫组织化学及Western-blot等技术检测S100A6 mRNA和蛋白的表达，TUNEL法检测细胞凋亡。结果成功构建了裸鼠肺腺癌皮下移植瘤模型；病理学特征显示，阴性对照组和空载体对照组可见到成巢的肿瘤细胞，癌细胞核大，而干扰组肿瘤细胞较稀疏，间质组织明显；接种细胞2周时，阴性对照组、空载体对照组和RNA干扰组肿瘤组织体积和质量差异具有统计学意义(P<0.05)；S100A6基因和蛋白表达在三组之间差异具有统计学意义(P<0.05)；各组裸鼠移植瘤凋亡细胞呈现不同程度的棕褐色肿瘤细胞核，三组肿瘤细胞凋亡率的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论下调肿瘤瘤组织S100A6蛋白表达，可抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡，为进一步开发肺腺癌分子靶点提供了新途径。

S100A6； 肺腺癌； 生长移植病； 细胞凋亡

原发性支气管肺癌(简称肺癌)发病机制不明，生物学行为极端恶性，缺乏有效的预测生物标志物。近年来发现，一类具有EF-手型模序结构的S100钙结合蛋白家族通过与靶蛋白的相互作用，启动细胞信号转导，参与细胞生长、分化、细胞周期及胞外基质分泌等多种生物学过程，并与肿瘤发生、发展及转移预后相关[1-2]。我们前期的研究证实，钙结合蛋白家族成员之一S100A6可在肺腺癌组织中表达明显上调，影响肺癌的生存与预后[3]。为进一步探讨S100A6 在体内参与肺腺癌恶性表型的生物学过程的作用特点，本研究应用反义寡核苷酸技术敲除人肺腺癌A549细胞S100A6基因表达，建立肺腺癌荷瘤裸鼠模型，观察裸鼠移植瘤成瘤情况，旨在探讨S100A6基因表达及其对肿瘤细胞凋亡的影响，为明确S100A6基因对肺腺癌生物学行为影响的作用机制提供理论依据。

资料与方法

一、实验材料

二、主要试剂

RPMI 1640培养基(购自GIBCO)、胎牛血清(购自TBD)、双抗(青霉素、链霉素)，胰酶(购自北京赛驰生物)、AxyPrep质粒小量制备试剂盒(Axygen公司)，T4 DNA连接酶(NEB公司)，NucleoBondXtra Midi Plus(MACHEREY-NA GEL公司)，限制性内切酶BamH I、EcoR I、Kpn I，SYBR○RGreen I(Takara公司) ， BSA(Sigma公司)，高效感受态细胞制备试剂盒(Sagon公司)。

三、实验步骤

1. 重组慢病毒质粒感染A549肺腺癌细胞: 制备S100A6基因RNA干扰慢病毒载体，慢病毒颗粒的包装，逐孔稀释法病毒滴度测定。将人肺腺癌A549细胞培养于含100 g/L胎牛血清的RPMI1640培养液中，取第三代处于对数生长期A549细胞接种于6孔培养板中，待细胞生长融合约60%左右进行转染。共分为3组：①空载体对照组：转染只携带GPH而不携带目的基因的空载质粒；②阴性对照组：未转染任何质粒；③S100A6 RNA干扰组(pLenR-GPH- shRNAi-S100A6)：转染干扰目的基因及GPH质粒。病毒感染96 h后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光(green fluorescence protein, GFP)，以观察病毒对目的细胞的感染情况，感染效率=荧光细胞数/总细胞数×100%。

2. 肺腺癌裸鼠种移植瘤模型的建立: 本研究动物成瘤参照Shen等[4]建立的方法，将三组对数生长期的细胞，用胰酶消化，完全培养基中止，收集细胞沉淀后，洗一次，离心后用无血清的重悬，调成细胞密度为5×107。将18只裸鼠随机分为三组，分别为: 空载体对照组, 阴性对照组, S100A6 RNA干扰组，每组6只，每只裸鼠分别于背部及腋部皮下三个部位注射相应的细胞约200 μl，种植肿瘤细胞数5×107，每组接种18个部位。

3. 动物成瘤观察: 自细胞接种之日起，观察三组裸鼠种植瘤的生长，待肿瘤出现后用游标卡尺测量肿瘤的大小，长径用a表达，短径用b表示，肿瘤的体积则用V=1/2ab2计算。第14天将所有裸鼠处死，取出瘤块测量体积，称重。常规石蜡包埋，HE染色，光镜下观察细胞结构与形态。

4. Real-Time PCR 检测移植瘤S100A6基因表达: 组织冰上匀浆: 4 ℃，以离心半径8 cm，12 000 min离心5 min；小心倒掉上清液，空干RNA沉淀；在RNA沉淀中加入适量的DEPC水、1 μl DNaseI (RNase free)和相应酶buffer于37 ℃水浴30 min，溶解RNA并除去RNA中的基因组DNA污染；按照Trizol说明书提取RNA，取适量RNA样品，用核酸蛋白定量仪测定OD260/OD280值和浓度，同时取适量RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳以鉴定RNA的质量，然后保存于-80 ℃冰箱。测定总RNA的纯度，将RNA逆转录为cDNA，以适量cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶催化PCR扩增。S100A6上游引物：5′-ATGGCATG CCCCCTGGAT-3′，下游引物为：5′-TGAGGGCTTCATTGTAGATC-3′； 荧光定量PCR扩增条件的设置：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s 60 ℃30 s；72 ℃ 30 s循环35次，72 ℃检测信号。

5. 免疫组化检测S100A6表达: 肿瘤组织均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。免疫组化染色按试剂盒说明进行：石蜡切片经脱蜡、水化，3% H2O2室温孵育15 min封闭内源性过氧化物酶，PBS 漂洗、加封闭液孵育15 min后，一抗滴加后4 ℃孵育过夜，滴加二抗，DAB 显色，苏木素复染。阳性细胞数分级标准参考Sato等[5]方法，阳性细胞10%以下为0分，10%～49%为1分，50%～69%为2分，≥70%为3分；信号强弱的判断标准：低或者基本无显色为0分，弱阳性为1分，阳性为2分，强阳性为3分；两项评分相乘，≤2为低表达(+)，3～4为中表达(++)，6～9为高表达(+++)。

①病人的一系列的行为举止和本研究中提到的病的是一样的。②痴傻的一百八十天里面有过中风，痴傻的时间超过了三百六十天。③虽然人格的要素还比较完整，但是没办法准确的获取外界信息，现象具有阶梯的特征。④中风出现过多次，没办法以正常的状态行走。⑤有很大的几率后面会得脑血管这个病。

6. Westerrn-blot检测S100A6蛋白表达: Wester-blot参考Ishii A等[6]所应用的方法，组织剪切成细小的碎片，每100毫克组织加入1 ml RIPA裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，将匀浆物转移到1.5 ml离心管，12 000×g，4 ℃离心5 min，取上清，采用BCA进行蛋白质定量后置-80 ℃贮存备用；灌制12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，半干法电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，加入兔抗人S100A6多克隆抗体(1︰200稀释)，4 ℃孵育过夜；TBST溶液洗膜3次，加入过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1︰2 000)，37 ℃孵育2 h；化学发光法显色，图像经Uvpgrabit Image软件测定各条带的吸光度，以S100A6/GAPDH条带积分光密度值的比值表示S100A6蛋白的相对表达量。

7. TUNEL凋亡分析: 石蜡切片常规脱蜡至水，蒸馏水振洗，蛋白酶K 消化，按TUNEL检测试剂盒说明进行操作。光学显微镜观察，细胞核内出现深棕色颗粒为凋亡阳性表现，随机观察5个高倍视野，每个视野连续计数100个细胞的凋亡细胞数，以平均数为凋亡指数( apoptotic index, AI) 。

结 果

一、A549肺腺癌细胞病毒感染效率

重组慢病毒感染A549肺腺癌细胞后，通过荧光显微镜观察稳定感染细胞系的GFP表达情况。结果显示，随着时间的增加，荧光表达逐渐增强，至72 h表达最强；荧光显微镜下观察发出绿色荧光的细胞数量，经计算慢病毒感染，感染A549细胞效率为87.50%，可以用于后续相关实验，见图1。

二、动物成瘤观察

接种细胞两周时裸鼠可见肿瘤的生长，其中S100A6 RNA干扰组有6只裸鼠均发现有肿瘤生长，接种肿瘤细胞的18个部位中有11个出现肿瘤病灶，成瘤率为61.1%；空载体对照组6只裸鼠成瘤全部成瘤，16个部位出现肿瘤病灶，成瘤率为88.9%，阴性对照组15个部位出现肿瘤病灶，成瘤率为83.3%，见图2。三组成瘤率差异无统计学差异(P>0.05) 。成瘤第14天将所有裸鼠处死，取出所有肿瘤组织，测得阴性对照组、空载体对照组和S100A6 RNA干扰组肿瘤组织体积分别是(0.2988±0.0352)cm3，(0.3127±0.0356)cm3和(0.1479±0.0480)cm3，三组之间体积差异具有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组、空载体对照组和S100A6 RNA干扰组肿瘤组织质量分别是(0.3137±0.0349)mg，(0.3277±0.0371)mg 和 (0.1517±0.0413)mg，三组之间肿瘤质量的差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 三组裸鼠接种A549肺腺癌细胞14天成瘤肿瘤组织体积及质量比较；注：A：体积比较；B：质量比较；1：阴性对照组；2：空载体对照组；3：S100A6 RNA干扰组；*与阴性对照组相比，P<0.05；#与空载体对照组相比，P<0.05

三、HE染色观察肿瘤组织病理

移植瘤组织切片HE染色，光镜下观察病理学特征，阴性对照组和空载体对照组肿瘤可见到成巢的肿瘤细胞，癌细胞核大、异型、浓染、核仁突出，干扰组肿瘤细胞较稀疏，间质组织明显，核异型性明显，见图4。

四、Real-Time PCR 检测移植瘤S100A6基因表达

应用Real-Time PCR技术检测移植瘤组织S100A6蛋白基因表达，阴性对照组为0.047±0.018，空载体对照组为0.040±0.008，RNA干扰组0.018 ±0.006,三组之间差异具有统计学意义(P<0.01)，见图5。

图5 Real-time PCR检测移植瘤组织S100A6mRNA表达；注：三组mRNA相对表达比较；*与阴性对照组相比，P<0.05；#与空载体对照组相比，P<0.05

五、S100A6表达免疫组织化学分析

S100A6 蛋白的免疫着色主要位于细胞质和细胞膜，肿瘤间质和细胞核未见染色。阴性对照组S100A6低表达2例(33.3%)，中表达4例(66.7%)，无高表达；空载体对照组低表达1例(16.7%)，中表达5例(83.3%)，无高表达；RNA干扰组低表达5例(83.3%)，中表达1例(16.7%)，无高表达，见表1和图6。

表1 应用免疫组织化学法检测S100A6在三组移植瘤肿瘤组织差异表达

六、S100A6表达Western-blot分析

Western-blot免疫印迹条带结果显示，S100A6蛋白相对表达量在阴性对照组为0.313±0.120，空载体对照组0.349±0.104，RNA干扰组0.132±0.057，三组间差异具有统计学意义(P<0.05)，见图7。

图7 Western-blot检测裸鼠成瘤S100A6蛋白表达；注：A: western-blot 电泳条带，1-1 阴性对照组，2-1空载体对照组，3-1 RNA干扰组；B:S100A6蛋白相对表达量比较，*与阴性对照组相比，P<0.05，#与空载体对照组相比，P<0.05

七、TUNEL 法检测移植瘤细胞凋亡

各组裸鼠移植瘤凋亡细胞呈现不同程度的棕褐色染色肿瘤细胞核(图7A、B、C所示)， RNA干扰组与阴性对照组和空载体对照组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组和空载体对照组比较差异均无统计学意(P>0.05)，见图8。

讨 论

S100A6蛋白最初由Kuznicki和Filipek在Ehrlich腹水瘤中检出，主要存在于胞质、胞膜以及核被膜上。S100A6基因位于人染色体的lq21的250～350 kb之间，并与S100A1～5、S100A7～10，S100C等S100基因家族成员、表皮分化基因及原癌基因ski比邻。生理状态下S100A6的分布受钙离子浓度的影响，在G0期到S期时达最高水平，与细胞进入S期有关[7]，但在组织发生恶性变时其表达明显失控[8]。研究显示，S100A6在人急性粒细胞白血病、人子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌、结直肠肿瘤、甲状腺肿瘤、恶性纤维组织瘤、黑色素细胞瘤、神经母细胞瘤、口腔黏膜的鳞状细胞癌、各种类型的皮肤肿瘤以及上皮来源的肿瘤细胞系等多种增殖旺盛的细胞中均高表达[9]。我们前期的研究发现，S100A6在肺腺癌中表达显著高于正常肺组织[10-11]，但是S100A6基因在体内影响肺腺癌的发生、发展相关机制目前尚不清楚。

本研究首先通过S100A6基因RNA干扰慢病毒载体转染肺腺癌A549细胞，随后将含有S100A6基因干扰序列肿瘤细胞悬液接种于健康Balb/c雄性裸鼠，建立了裸鼠皮下移植瘤模型。实验结果显示，与阴性对照组和空载体对照组比较，RNA干扰组S100A6基因和蛋白表达显著下调；三组在动物成瘤率无差异，但RNA干扰组的移植瘤体积和质量均显著低于对照组，提示S100A6基因敲除可诱发细胞增殖相关蛋白的下调，显著影响肿瘤细胞生长，降低肿瘤细胞的增殖能力。Yamaguchi等[12]在对MLL-AF4和Fms样酪氨酸激酶3对白血病协同作用机制的研究中发现，增强表达的S100A6在MLL-AF4相关的白血病生成中具有重要作用，而反义S100A6小干扰RNA 可下调白血病细胞增殖。Omnicki 等[13]发现在S100A6基因缺陷的骨母细胞及胰腺癌细胞，其增殖能力明显也受到抑制。

DNA损伤是细胞凋亡过程中必经环节之一，细胞凋亡时胞内核酸内切酶活化，后者将DNA链在核小体间连接区切成缺口，使核内DNA断裂成小片断。在组织细胞原位DNA切口可被脱氧核糖核酸转移酶末端标记，因此应用DNA片段原位末端标记技术(TUNEL)可及时发现细胞DNA断裂损伤，反应细胞凋亡情况。研究发现，S100A6是也一个细胞周期和凋亡相关蛋白。Matsumoto等[14]发现S100A6 mRNA 在人上皮来源的肿瘤细胞系，如口腔鳞癌、黑色素瘤的S期表达增加，G1/G2 期表达降低，它在肿瘤细胞受某些生长抑制剂VP-16 和佛波酯的作用生长变慢时表达降低。本实验采用TUNEL方法检测裸鼠移植瘤组织肿瘤细胞凋亡情况，发现肿瘤组织细胞核可呈现不同程度的棕褐色染色，提示为凋亡细胞；RNA干扰组与阴性对照组和空载体对照组比较，凋亡细胞明显增加，表明通过干预S100A6基因表达有可抑制肿瘤增殖与发展。

图8 TUNEL法检测移植瘤凋亡细胞及各组凋亡细胞数比较；注：A：阴性对照组，B：空载体对照组， C：RNA干扰组，D：各组凋亡细胞数比较， *与阴性对照组相比，P<0.05，#与空载体对照组相比，P<0.05(×400)

S100A6在蛋白质或mRNA上调受多个细胞因子的调控，包括血小板源生长因子、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、维甲酸等[15-16]；S100A6基因也可间接通过与p53相互作用抑制其转录，调控细胞的增值和凋亡[17-18]。Slomnicki 等[19]应用亲和色谱法和免疫共沉淀技术发现S100A6可引起p53转录活性增高，诱导细胞对凋亡敏感性增加，同时应用电泳迁移率变动分析发现S100A6并没有影响p53与DNA结合。本研究结果显示，应用S100A6基因RNA干扰构建的裸鼠移植瘤动物模型，可通过下调肿瘤瘤组织S100A6蛋白表达，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长，为进一步研发肺腺癌分子靶点提供了新的途径。

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(本文编辑：张大春)

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Influence of S100A6 gene down-regulation on growth and apoptosis of transplanted lung adenocarcinoma in nude rats

NanYandong1,JiangHua1,FangYanfeng1,JinFaguang1,YangShuanying2.

1DepartmentofRespiratoryDisease,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038,China;2DepartmentofRespiratoryDisease,SecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China

NanYandong,Email:nanyandong2008@163.com

Objective S100A6 can regulate cell proliferation, differentiation, cell cycle and apoptosis by interacting with target proteins under the condition of calcium ion existence. S100A6 gene is highly expressed in multiple tumor tissues and is closely related to the occurrence and development of tumor. The aim of this study is to explore the influence of S100A6 gene down-regulation on growth and apoptosis of transplanted lung adenocarcinoma in nude rats. Methods Eighteen healthy male Balb/c nude mice were randomly divided into three groups: empty vector control group (n=6), negative control group (n=6) and S100A6 gene RNA interference (RNAi) group (n=6). The transplanted lung adenocarcinoma models were established by subcutaneous injection of A549 lung adenocarcinoma cells line with empty vector, non-carrier vector and pLenR-GPH-shRNAi-S100A6, respectively. The growth of transplanted tumor in different groups was observed. The expression of S100A6 gene was detected using real-time PCR, immunohistochemistry and western-blot methods. Apoptosis cells were analyzed by Terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL). Results The transplanted lung adenocarcinoma models in nude rat were successfully established. The pathological features showed that typical tumor cells formed solid hest-like mass. The tumor cell nucleus in empty vector control group and negative control group got bigger. The tumor cells in S100A6 RNAi group were relatively looser and their interstitial components became obvious. The tumor volume and mass among three groups had significant difference(P<0.05). The expression of S100A6 gene of RNAi group was significantly lower than that of empty vector control group and negative control group(P<0.05). The apoptosis rate had significantly difference among three groups(P<0.05). The nucleus of apoptosis cell in transplanted lung adenocarcinoma showed brown. Conclusions Down-regulation expression of S100A6 in lung adenocarcinoma could inhibit tumor growth and induce cell apoptosis, which could provide new pathway for further study of molecular target spot of lung adenocarcinoma.

S100A6; Lung adenocarcinoma; Growth transplant disease; Apoptosis

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.002

国家自然科学基金资助项目(81001040)

710038 西安，第四军医大学唐都医院呼吸与危重症医学科1710004 西安，西安交通大学第二附属医院呼吸内科2

南岩东，Email：nanyandong2008@163.com

R563

A

2016-01-03)