蝉蜕水提物对小鼠D—氨基半乳糖急性肝损伤的保护作用

李兆叠+陆秋娜+齐梁煜+杨文林+零新岚+韦家河+黄彦峰+冯雪萍

摘要：探討不同浓度蝉蜕水提取物对小鼠D-氨基半乳糖（D-GalN）急性肝损伤的保护作用。将60只小鼠随机分为空白对照组、D-GalN模型组（模型组）、联苯双酯滴丸组、蝉蜕水提取物低、中、高3个剂量组，共6组。每组小鼠均按每千克体重剂量灌胃给药，连续给药13 d，末次给药12 h后，按600 mg/kg腹腔注射10% D-GalN诱导急性肝损伤模型。造模24 h后，计算小鼠肝指数，测定血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性及心肌组织、肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，HE染色观察肝组织病理学变化。结果表明，与空白对照组比较，模型组小鼠肝脏指数及血清ALT、AST活性升高（P<0.01），肝脏、心肌组织中SOD活性降低，MDA含量增高（P<0.01），肝组织炎症坏死广泛。与模型组比较，蝉蜕水提取物的低、中、高剂量组及联苯双酯组小鼠肝脏指数及血清ALT、AST活性降低（P<0.01或P<0.05），肝脏、心肌组织中SOD活性升高，MDA含量降低（P<0.01或P<0.05），肝组织损伤程度显著改善。蝉蜕水提取物对D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤有一定的保护作用。

关键词：蝉蜕；D-氨基半乳糖；肝损伤；保护作用

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）12-2313-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.028

Protective Effect of Periostracum cicdae Water Extract on D-galactosamine Induced Acute Liver Injury in Mice

LI Zhao-die，LU Qiu-na，QI Liang-yu，YANG Wen-lin，LING Xin-lan，

WEI Jia-he，HUANG Yan-feng，FENG Xue-ping

（Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi， China）

Abstract：To explore the protective effect of Periostracum cicdae water extract on D-GalN induced acute liver injury in mice.60 mice were randomly divided into 6 groups，blank control group，D-GalN model group （model group），bifendate pills group，water extract of Periostracum Cicadae low，middle，and high dose group. Each group of mice per kg of body weight dose administered by gastric administration，continuous administration of 13 d，on the last day of administration，according to the dosage of 600 mg/kg intraperitoneal injection of 10% D-GalN induced acute liver injury model. Modeling for 24 h，the calculation of the liver index，serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST） activity and myocardial tissue，liver tissue superoxide dismutase（SOD） activity and malondialdehyde（MDA） content. HE staining and pathological changes of liver tissue were observed. Results showed that compared with the blank control group，the liver index and the serum ALT，AST activity increased（P<0.01），liver，myocardial tissue SOD activity decreased，MDA content increased（P<0.01），liver tissue inflammatory necrosis of the liver.Compared with the model group，cicada slough water extract of low， middle，high dose group and bifendate pills groups of mice liver index and serum ALT，AST activity reduce （P<0.01 or P<0.05），liver，the myocardial tissue of SOD in myocardium increased，decreased the content of MDA（P<0.01 or P<0.05），The degree of liver tissue injury was significantly improved. The water extract of Periostracum cicdae has protective effect on D-GalN induced acute liver injury in mice.

Key words：Periostracum cicdae； D-galactosamine； liver injury； protective effect

随着人类生活环境及饮食习惯的改变，肝脏疾病已成为威胁人类重要疾病之一，在中国以病毒性肝炎为主。因此，寻求抗肝损伤、肝纤维化等药物日益受到关注[1-3]。

蝉蜕为蝉科（Periostracum cicdae）昆虫黑蚱的幼虫羽化时脱落的皮壳。蝉蜕性甘、寒，归肺、肝经。蝉蜕内含甲壳质（chitin）、蝶啶类色素、异黄质喋呤（isoxanthopterin）、赤蝶呤（erythropterin）、蛋白质、氨基酸、有机酸、酚类等化合物。蝉蜕有疏散风热、利咽、透疹、明目退翳、解痉等功能，目前临床上常用于治疗风热感冒、咽痛音哑、麻疹不透、风疹瘙痒、目赤翳障、惊风抽搐、破伤风[4]、疏风除热、哮喘[5]等疾病。本试验以小鼠为研究对象，初步探讨蝉蜕水提取物对D-氨基半乳糖胺致小鼠急性肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 蝉蜕，购买于广西壮族自治区百色市某大药房；联苯双酯滴丸（广州白云山星群药业股份有限公司，批号A02141102）；D-氨基半乳糖（D-GaIN，上海源叶生物科技有限公司，批号YS0918TA14）；谷丙转氨酶（ALT）、 天冬氨酸转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、考马斯亮蓝（均购于南京建成生物工程研究所，批号分别为20150918、20150909、20150922、20150820、20150923）。

1.1.2 仪器 TD24A-WS型低速台式离心机、722型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），XW-80A型旋涡混合器（上海医科大学仪器厂），FSH-2A型可调高速电动匀浆机（金坛市金南仪器厂），TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器），HH-W600型三用恒温水浴箱。

1.1.3 动物 昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重23～27 g，由右江民族医学院动物实验中心提供，合格证：SCXK（桂）2012-0003。

1.2 方法

1.2.1 蝉蜕提取物的制备[6] 将蝉蜕放入清水中反复清洗，直至清洗蝉蜕的水变清澈，放入烘干箱中烘干，冷却后粉碎并准确称取100 g，按料液比1∶10加入1 000 mL蒸馏水，冷凝回流提取1 h，冷却至室温后过滤，保存滤液并重新收集滤渣，再按料液比1∶8加入800 mL蒸馏水回流提取1 h，冷却后过滤并合并两次滤液，蒸发浓缩至恒定体积，4 ℃冷藏备用。

1.2.2 动物分组及给药 取60只小鼠按体重随机分为空白对照组、模型组、联苯双酯滴丸组（0.15 g/kg）、蝉蜕水提取物的低、中、高（0.60、0.75、0.90 g/kg）剂量组共6组，每组10只。每组小鼠均按每千克体重剂量灌胃给药，空白对照组和模型组每天给予等体积的生理盐水，每天给药1次，连续给药13 d。

1.2.3 D-GaIN急性肝损伤模型的建立 给药前将D-GaIN碾碎溶解并配制成10%生理盐水溶液，加入1 mol/L NaOH调pH至7.0。造模各组小鼠末次给药12 h后，按600 mg/kg腹腔注射10% D-GaIN溶液[7]； 空白对照组给予等体积的生理盐水。小鼠禁食不禁水，末次给药24 h后再次称重，小鼠眼球采血，处死小鼠后迅速取出肝脏及心脏组织。

1.2.4 生化指标的测定 小鼠眼球取血后3 000 r/min离心10 min，取血清冷藏备用，按相应试剂盒说明分别测定血清中ALT和AST活性。取肝左叶0.6～0.8 g按质量比1∶9加入预冷的生理盐水匀浆制备10%的组织匀浆，以3 500 r/min离心10 min，取上清液冷藏保存，按试剂盒说明分别测定小鼠肝组织及心肌组织中的SOD活性、MDA含量。

1.2.5 病理组织学检查 用10%的甲醛溶液固定小鼠肝右叶，石蜡包埋，切片后用常规HE染色制片，在光镜下观察肝组织结构变化及细胞形态学的改变。

1.2.6 统计学数据处理 试验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，结果用x±S表示，应用单因素方差分析及t检验进行比较，P<0.05时则表示该差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 各组小鼠体重与肝脏指数

由表1可以看出，与空白对照组比较，各组小鼠体质量未见明显差异，表明蝉蜕水提取物在试验条件下对动物的体重无明显影响。与模型组比较，各组小鼠肝指数降低（P<0.01或P<0.05）。

2.2 各组小鼠血清AST、ALT水平

由表2可以看出，与空白对照组比较，模型组小鼠血清中的AST和ALT活性极显著升高（P<0.01），表明小鼠急性肝损伤模型造模成功。与模型组比较，联苯双酯滴丸、蝉蜕水提取物的低、中、高剂量组小鼠血清中的AST和ALT活性下降（P<0.01或P<0.05）。

2.3 各组小鼠心肌组织SOD、MDA水平

由表3可以看出，与空白对照组比较，模型组小鼠心肌组织的SOD活性降低、MDA含量上升（P<0.01）。與模型组比较，联苯双酯滴丸、蝉蜕水提取物的低、中、高剂量组小鼠心肌组织的SOD活性上升（P<0.01），MDA含量降低（P<0.01或P<0.05）。

2.4 各组小鼠肝脏组织SOD、MDA水平

由表4可以看出，与空白对照组比较，模型组小鼠肝脏组织的SOD活性降低、MDA含量上升（P<0.01）。与模型组比较，联苯双酯滴丸、蝉蜕水提取物的低、中、高剂量组小鼠肝脏组织的SOD活性上升（P<0.01或P<0.05），MDA含量降低（P<0.01或P<0.05）。

2.5 各组小鼠肝组织病理形态学变化比较

由图1可以看出，空白对照组肝组织结构及肝细胞正常，无溶解及坏死；模型组的肝细胞呈弥漫性水肿，胞浆肿胀透亮、疏松，肝细胞核溶解、坏死及消失，病变以小叶中央静脉周围的肝细胞为重；联苯双酯滴丸组的肝小叶结构大致正常，无肝细胞变性坏死，再生细胞较少；与模型组比较，蝉蜕水提取物治疗组肝细胞形态明显好转，肝细胞溶解、坏死明显减少，并伴有少量肝细胞再生，特别中剂量组改善最明显。

3 小结与讨论

研究证实，D-GaIN诱导的急性肝损伤与病毒性肝炎相似，能直接或间接地诱导生物膜系统发生脂质过氧化，同时可破坏肝细胞膜结构和功能完整性，是目前最接近人类临床病毒性肝炎病理变化的理想模型[8，9]。

肝细胞内含有AST与ALT，一般情况下血液中仅含少量，但是当肝细胞裂解坏死时，AST与ALT则大量进入血液系统循环。因此，通过测定血清中的AST与ALT含量能有效地反映肝细胞变性程度[10]。SOD具有催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的性质，可作为超氧阴离子自由基的清除剂，可防止细胞损伤，同时SOD在哺乳动物体内与其寿命长短有较重要的关系，因此其含量的变化可以用来反映细胞的抗氧化能力，即损伤程度[10，11]、抗衰老能力[6，8]。MDA是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，具有较强毒性，可导致细胞裂解坏死，破坏蛋白和酶的结构和功能，因此可以用MDA含量来间接评价组织脂质过氧化程度[12，13]。

本研究中模型组小鼠血清中ALT、AST含量明显升高，肝脏指数增加，表明D-GalN模型复制成功，而小鼠肝脏、心肌组织中SOD活性降低，MDA含量增高，提示模型组小鼠体内有氧化应激反应的发生。病理形态学显示肝细胞受损严重，表明脂质过氧化增强导致肝细胞损伤。通过蝉蜕水提取物治疗后，能明显降低D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤血清中ALT、AST水平，增强小鼠肝脏、心肌组织中SDO活性，降低MDA含量，同时还明显减轻肝组织炎症病变程度。由此提示，蝉蜕水提取物可能通过催化超氧阴离子自由基发生歧化，降低肝细胞、心肌细胞内氧化脂质的水平，促进氧自由基的清除，提高机体的抗氧化来保护肝细胞的损害。蝉蜕水提取物对D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤有一定的保护作用，推测其机制可能与减轻脂质过氧化、清除自由基、提高机体的抗氧化、保护肝细胞膜等有关。

参考文献：

[1] 张 睿，陈金锋，高家荣，等.疏肝健脾方对化学性肝损伤的保护作用[J].中药药理与临床，2014，30（2）：140-143.

[2] 吕纪华，邓聿胤，刘 瑛，等.乙肝清对小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（6）：253-256.

[3] 曹國琼，张永萍，隋艳华，等.甘宝胶囊对小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（1）：264-267.

[4] 国家药典编委会.《中华人民共和国药典》2010版[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[5] 陈希明.蝉蜕散治疗小儿风热犯肺型咳嗽变异性哮喘的临床研究[D].广州：广州中医药大学，2014.

[6] 文全泰，潘廷啟，黄礼德，等.土人参提取液对D-半乳糖所致衰老小鼠的抗氧化作用研究[J].天然产物研究与开发，2014（5）：662-665.

[7] 李 梅，谷淑玲，马腾飞.D-氨基半乳糖胺致小鼠、大鼠肝损伤模型的实性研究[J].徐州医学院学报，2007，27（2）：86-88.

[8] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海：上海科技出版社，2006.

[9] 史秀玲，高银辉.绿原酸对小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（19）：199-202.

[10] 李远辉，黄挺章，郭圣奇，等.亚麻子提取物对D-半乳糖胺致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2015， 21（16）：139-142.

[11] RIDER L，DIAKONOVA M. Adapter protein SH2B1βbinds filamin A to regulate prolactin-dependent cytoskeletal reorganization and cell motility[J].Mol Endocrinol，2011，25（7）：1231-1243.

[12] 周宗灿.氧化还原信号和氧化应激-还原应激[J].毒理学志，2015，29（1）：1-14.

[13] KAIRANE C，ROOTS K，UUSMA T，et al. Regulation of the frontocortical sodium pump by Na+ in Alzheimer's disease： Difference from the age-matched control but similarity to the rat model[J].FEBS Leu，2002，531：241-244.