某区慢性阻塞性肺疾病下呼吸道感染的病原菌检测、药敏结果及临床价值

2017-07-12 14:04谢志斌彭梅君叶艳珍

中国医药指南 2017年14期

关键词：革兰致病菌球菌

曾晓谢志斌刘钧彭梅君杨青叶艳珍张鹏

（湖北省孝感市中心医院呼吸内科三，湖北孝感 432000）

某区慢性阻塞性肺疾病下呼吸道感染的病原菌检测、药敏结果及临床价值

曾晓谢志斌*刘钧彭梅君杨青叶艳珍张鹏

（湖北省孝感市中心医院呼吸内科三，湖北孝感 432000）

收集孝感市中心医院慢性阻塞性肺疾病痰标本306例，标本直接涂片革兰染色细胞学计数，同时观察白细胞和病原菌关系的现象，并收集患者相关临床资料。综合三方面对所生长的潜在病原菌进行判断。以患者依据药物敏感实验结果、用药后的疗效以及有无感染症状体征为判断依据。白细胞吞噬细菌或与细菌并存现象的标本有135份培养的细菌均确定为感染病原菌，感染率显著高于未观察到白细胞吞噬病原菌或与病原菌并存现象的标本（100% vs 23.2%，P＜0.005）。下呼吸道感染分离的病原菌主要以革兰阴性杆菌为主，位列前五位的依次为肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌；分离的革兰阳性球菌主要以金黄色葡萄球菌为主，第二位的是肺炎链球菌；分离出的真菌仍主要以念珠菌属为主（占真菌62%）本研究分离的肺炎克雷伯菌对常用抗生素的耐药率较高，除亚胺培南、阿米卡星耐药率低于30%，其他抗生素均高于30%，大肠埃希菌对亚胺培南的耐药率低于10%，对环丙沙星耐药率超过70%；铜绿假单胞菌对阿米卡星、亚胺培南、头孢他啶的耐药率均低于30%，革兰阴性菌整体对氨苄西林、头孢唑林的耐药率较高，分别达85.8%、82.6%。未发现对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌。结论下呼吸道感染分离的病原菌主要以革兰阴性杆菌为主。革兰阴性杆菌对亚胺培南、阿米卡星具有较高的敏感性。革兰阳性球菌对万古霉素无耐药。确定病原菌必须综合患者的临床资料，直接涂片的表现，细胞学及白细胞与病原菌的关系和培养生长情况三个方面来确定感染病原菌。

慢性阻塞性肺疾病；下呼吸道感染；病原菌检测；药敏；临床价值

慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期的定义：AECOPD是指COPD患者“急性起病，患者的呼吸困难、咳嗽和（或）咳痰症状变化超过了正常的日间变异，须改变原有治疗方案的一种临床情况”。其最常见的原因是支气管树的感染和大气污染[1]，由于口咽部有大量正常生理菌群，咳痰标本受口咽部生理菌群污染不可避免。对于典型的致病菌如白喉棒状杆菌、百日咳鲍特菌等，不受口咽部生理菌群影响，分离培养出即可视为病原菌。然而，随着医疗技术的提高，抗生素的广泛使用，典型的致病菌感染越来越少见，而条件致病菌的感染却逐渐上升。因此，对于痰标本培养出的条件致病菌如何判断其为呼吸道感染定植菌还是感染菌已经成为临床检验的难点，本文采用一种新的可用于判断痰液培养定植菌和病原菌的方法，结合药敏试验，以了解本院慢性阻塞性肺病患者的病原学特点及指导如何合理使用抗生素。

1 材料与方法

1.1 研究对象：选取本院2014年1月1日至2015年1月1日间住院患者痰标本306份。

1.2 标本处理

1.2.1 标本直接涂片，厚薄均匀，自然干燥后火焰固定，革兰镜检。

1.2.2 镜检内容：①细胞学检查：包括鳞状上皮（SEC）和中性粒细胞。依据《全国临床检验操作规程》第二版下呼吸道标本显微镜白细胞和鳞状上皮细胞计数判断标准[2]及美国第7版《临床微生物学》。相关标准：将标本分为A、B、C 三类（表1）；②细菌学检查：包括口咽部生理菌群（甲型溶血性链球菌、非治病奈瑟菌及厌氧菌等）和潜在病原菌；③细菌和细胞之间的关系：观察致病菌和中性粒细胞之间的关系，包括中性粒细胞吞噬细菌或细菌与细胞并存的现象。

1.3 标本培养：所有标本均接种羊血平板、巧克力平板和中国蓝平板，培养基半成品购自美国BD公司。

1.4 细菌鉴定：VⅠTEK全自动微生物鉴定系统，按仪器说明书操作。药敏纸片法:按2005年美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的纸片扩散法进行及判断结果。超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林葡萄球菌（M RS）的检测、筛选及确诊试验参照2005 年NCCLS推荐标准。观察三种平板生长情况，如果培养基有细菌生长，量达到1区以上即为阳性（一区密集生长为1+，二区生长为2+，三区生长为3+），进行鉴定和药物敏感试验，鉴定采用法国梅里埃公司VⅠTEK鉴定系统，药物敏感试验采用K-B法。

1.5 质量控制：选取ATCC 25922大肠埃希菌和ATCC25923金黄色葡萄球菌为质控菌株对上述实验过程进行质量控制。

1.6 病原菌确定标准：患者具有感染症状且依据药敏结果用药后治疗有效。

1.7 定植菌确定标准：患者无感染症状或有感染症状但依据药敏结果用药后治疗无效。

1.8 按照《全国临床检验操作规程》将老年患者痰标本接种在血琼脂和伊红美蓝培养基培养 18～24 h，观察菌落形态，进行革兰染色。应用VTEK自动细菌鉴定仪将细菌鉴定到种并进行药物敏感试验，抗生素包括亚胺培南西司他丁、哌拉西林他唑巴坦、阿莫西林克拉维酸钾、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢美唑、头孢唑啉、左氧氟沙星、舒普深、环丙沙星、青霉素、氨苄青霉素、苯唑西林、万古霉素、阿米卡星、庆大霉素、SMZ-CO、红霉素、利福平等，按NCC、LS标准用K-B法进行药敏试验，药敏结果统计用VTEK统计软件进行分析[2]。

1.9 统计学分析：采用SPSS 12.0统计分析软件进行处理，计数资料均用率表示，采用卡方检验，P＜0.05，具有差异统计学意义。

表1 痰液标本细菌培养合格标准

2 结果

2.1 阳性患者一般情况：306例患者年龄17～94岁，平均年龄68.4岁，其中70岁以上老年患者211例，占68.9%。男性患者224例，占73.2%。女性患者82例，占26.7%，有感染症状及体征者249例，占81.3%，无感染症状及体征者57例，占18.6%。培养前有使用抗生素274例，占89.5%，未使用抗生素者32例，占10.5%。

2.2 痰培养阳性细菌分布：共培养出致病菌305株，革兰阴性菌220株，占72.13%；革兰阳性球菌60株，占19.67%；真菌26株，占8.52%；其中培养出多重耐药菌69株，阳性率22.6%。

2.3 不同质量标本培养出的细菌之间定植率和感染率的比较：305株菌依据上述判断标准，确定为病原菌的构成比为48.3%，合格标本244份（79.7%），其中A类131份、B类113份。不合格标本C类62份。两类标本培养的细菌定植率和感染率比较结果见表2。在A类和B类中依据直接涂片镜检结果（是否具有感染免疫病理现象即中性粒细胞吞噬相应细菌或与细菌并存）分为两类，二者之间定植率与感染率的比较见表3。

2.4 不同种类细菌的感染率和定植率不同，肺炎球菌，流感杆菌，卡他的感染率为100%，非发酵菌定植率为71.3%。见表4。

2.5 慢性阻塞性肺疾病培养的细菌以革兰阴性菌为主，占72.13%，革兰阳性球菌占19.67%，真菌占8.25%。其中革兰阴性菌以肺炎克雷伯菌（14.75%）、铜绿假单胞菌（13.44%）、不动杆菌（10.82%）为主。革兰阳性球菌以金黄色葡萄球菌（6.88%）、肺炎链球菌（5.57%）、表皮葡萄球菌（3.28%）、肠球菌（1.64%）。见表5。

2.6 采用临床常用的18种抗生素对分离的COPD感染的主要革兰阴性病原菌进行耐药分析，本实验对4中主要的革兰阴性致病菌（肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、大肠埃希菌）进行耐药测定，发现革兰阴性菌整体对氨苄西林、头孢唑林、氯霉素耐药率最高，分别达到85.8%、82.6%、65.3%。对亚胺培南、头孢他啶、妥布霉素的耐药率最低，分别达到16.7%、30.3%、31.1%。见表6。

2.7 采用临床常用的13种抗生素对分离的COPD感染的主要革兰阳性球菌进行耐药分析，本实验中对3种常见的革兰阳性球菌（金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌）进行耐药性分析，发现革兰阳性球菌整体对青霉素、红霉素、氧氟沙星耐药率最高，分别达95%、88.6%、79.3%。对万古霉素、呋喃妥因、亚胺培南耐药率最低，分别为0%、19.1%、25.4%。未发现对万古霉素耐药的革兰阳性球菌。见表7。

3 讨论

当今社会科学技术飞速发展，随着抗生素的广泛使用，下呼吸道的感染病原菌不断变迁，过去典型的致病菌已经相对少见，相反，现在由条件致病菌导致的感染却不断增多，已成为下呼吸道感染的主要病原菌。典型的病原菌有典型的临床表现和特点，而且不受口咽部定植菌的影响，实验室检查出即可确诊。而条件致病菌的致病性是相对的，无典型的临床表现，而且不能通过实验室培养来确定是致病菌还是口腔定植菌，因此成为了临床医学的难点。

目前，痰培养是最广泛应用的病原学诊断技术，本例研究中，306例患者中，痰培养前使用抗生素274例，占89.5%，在这些患者中，机体免疫力低下，一般致病菌定植力遭到破坏，而定植力较强，侵袭力较弱的条件致病菌却很容易在呼吸道定植而成为致病菌。而痰培养出这些条件致病菌或连续两次以上分离出，即使患者有呼吸道症状和体征，也不能判断这些条件致病菌就是致病菌。

正常呼吸道存在大量生理菌群，通过营养竞争，占位保护等作用拮抗外来菌群的定植，机体的完整的黏膜也是重要的防御屏障。当外界多种致病因素如机体免疫力破坏，抗生素的过度使用等因素造成机体防御能力的下降，则病菌可入侵机体。如此同时，机体产生的炎性反应，包括炎性细胞的趋化（主要是白细胞）至炎症部位，识别并吞噬杀灭病原体[3]。因此，下呼吸道感染患者，不论是典型的致病菌还是条件致病菌感染，都会引起炎性反应，有白细胞趋化并吞噬杀灭病原菌的病理现象。其咳痰中必定带有大量的白细胞，直接涂片细胞学检查有助于致病菌与定植菌的判断。表2提示，合格标本分离出的病原菌显著高于不合格标本（61.9% vs 3.2%，P＜0.005），不合格标本几乎都是上呼吸道定植菌（96.8%）。白细胞吞噬异物（病原菌）是一种非特异性的免疫病理防御机制，即便是正常人的呼吸道中也有少量白细胞存在，因此咳痰标本即使合格其可接受的标本单纯细胞学计数也无法确定所培养的条件致病菌为感染病原菌。表2表明，合格标本仍有93例（39.7%）为定植菌。如前所述，白细胞浸润吞噬病原菌是机体炎性反应过程中必然的免疫病理现象，来自呼吸道炎症部位的咳痰一定有白细胞吞噬病原菌或与病原菌并存的现象，见图1，根据这一现象可以作为判断细菌为病原菌的直接证据。表3表明，本组研究中有白细胞吞噬伴行现象的感染率显著高于没有白细胞吞噬伴行的感染率（100% vs 21.2%，P＜0.005）。因此，痰标本中见到白细胞吞噬病原菌或与病原菌伴行现象的可以判断该细菌为致病菌。在未见白细胞吞噬伴行现象的合格标本中有24例（21.2%）为感染致病菌，这一现象可能与涂片敏感性有关。根据培养，可将病原菌分为四类，非发酵菌，肠杆菌科，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，卡他菌及葡萄球菌，不同种类细菌之间的感染率和定值率之间有显著性差异（P＜0.005），这与不同细菌之间的毒力，定值能力，侵袭力的不同有关。

表5 慢性阻塞性肺病感染病原菌种类及构成比

图1 痰培养定植菌与致病菌的判断

研究结果提示，革兰阴性杆菌是引起下呼吸道感染的主要致病菌，革兰阳性球菌相对较少。除了万古霉素没有耐药以外，致病菌对其他的抗生素均有不同程度耐药。由于氨苄西林的广泛应用，细菌已经对其产生了很高的耐药性，肺炎克雷伯菌对氨苄西100%耐药，不宜作为首选用药。本试验铜绿假单胞菌对氨苄西林、头孢唑啉、氨曲南的耐药率达到76.8%～90.2%，临床中可选择低耐药的阿米卡星、亚胺培南和头孢他啶，革兰阳性球菌整体对青霉素、苯唑西林，氧氟沙星、红霉素耐药率较高，对万古霉素不耐药，可作为感染时选用。对临床上常用的抗生素其耐药率较高，临床应用时应该注意联合用药以降低细菌耐药的发生。对年老体弱，长期大量使用抗菌药物治疗者，应特别警惕，尽早送检痰培养根据药敏试验报告，合理选择抗菌药物，调整经验用药，减少细菌耐药性的产生及菌群失调的产生[4]。